Th1/Th2细胞因子在眼肌型重症肌无力转基因小鼠模型中的作用机制

吴晓蓉，熊英琼，胡裕翔，许晓璇，程 艺，晏 立，吴雅俊，饶 杰

1南昌大学第一附属医院眼科，南昌 3300062江西省人民医院神经内科，南昌 330006

重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是一种以肌肉的易疲劳性和波动性为特征的获得性自身免疫性疾病，目前认为其发病机制主要与致病性乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)的产生有关。眼肌型MG(ocular MG，oMG)是MG的常见类型，这类患者仅有眼外肌受累，表现为上睑下垂及复视，未经治疗干预多数oMG可进展为全身型MG(generalized MG，gMG)[1]。迄今为止，oMG的发病机制及其进展机制仍不明确，有研究表明Th1细胞和Th2细胞的细胞间平衡失常可能与MG的发生发展密切相关[2- 3]。本课题组前期研究利用重组人AChR(H-AChR)亚单位免疫HLA转基因小鼠建立了眼肌型实验性自身免疫性MG(ocular experimental autoimmune MG，oEAMG)模型[4- 7]，此模型在临床、病理等方面极大程度地模拟了oMG，为oMG致病机制的研究提供了重要研究手段。本研究拟通过观察HLA-DQ8转基因小鼠经H-AChR γ亚单位免疫诱导构建oEAMG模型过程中，oEAMG小鼠脾脏和淋巴结细胞体外培养上清液中Th1、Th2细胞相关细胞因子水平，进一步探讨不同亚群Th细胞分泌的细胞因子在oEAMG致病机制中的作用。

材料和方法

主要试剂与仪器H-AChR [TE671细胞中提纯，人源性细胞系表达天然含γ亚单位胚胎型AChR(α2βδγ)] 购自美国Immune Globe Biotech公司，Mouse TNF ELISA试剂盒、Mouse IFN-γ ELISA试剂盒、Mouse IL- 2 ELISA试剂盒、Mouse IL- 6 ELISA试剂盒购自美国BD公司；酶联免疫检测仪(BIO-RAD680型)购自美国BIO-RAD公司。

实验动物HLA-DQ8转基因小鼠均购自美国Jackson Laboratory公司；实验小鼠周龄为7～8周，雄性，体质量(26±2)g；所有小鼠以C57BL/10小鼠为遗传背景，仅携带人HLA-DQ8分子，不表达鼠MHC Ⅱ类基因(Aβ0.DQ8)。本研究涉及的动物实验符合南昌大学第一附属医院医学伦理委员会的要求，操作流程遵循实验动物操作管理规范指导说明进行，并且已尽最大可能减少实验动物的用量，减缓动物痛苦。

动物模型的建立与评估将27只HLA-DQ8转基因小鼠随机分为3组，即H-AChR γ亚单位免疫组、完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)免疫组和E.Coli.提取物免疫组，每组9只。参照Wu等[4- 5]方法，于第0天分别用乳化于CFA的重组H-AChR γ(20 μg)亚单位、纯CFA和E.Coli提取物在各组小鼠双侧肩下及足垫共4个位置局部皮下均匀注射50 μl/点(200 μl/只)免疫，于第30天、第60天在相同部位用相同剂量加强免疫2次。并自第2次免疫起，每周2位实验者采用双盲法在同一时间参照Wu等[4- 5]评分标准对各组小鼠进行1次眼部和全身临床症状评估，2位观察者的测量结果相关系数r>0.8。

血清AChR-Ab水平检测参照Wu等[4- 5]方法，于第2次免疫后15和45 d分别自H-AChR γ亚单位免疫组、CFA免疫组和E.coli免疫组小鼠尾静脉采血并分离血清于-20 ℃保存。采用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)检测各组小鼠血清AChR-Ab水平，AChR-Ab的量根据125I α-银环蛇毒素结合位点沉淀物数量计算，所有实验值以实测值减去正常对照小鼠平均水平表示，单位以nmol/L表示[8]。

体外培养淋巴细胞上清液中细胞因子水平检测建模小鼠于第3次免疫后28 d采用颈椎脱臼迅速处死，所有处死小鼠均于75%酒精中浸泡消毒5 min，在无菌条件下分别摘取腹股沟淋巴结、腋窝淋巴结、颈部淋巴结以及脾脏组织，再经RPMI1640培养基反复清洗，200目不锈钢网研碎并过滤，室温下300×g离心5 min，收集细胞，弃上清。通过加入 RPMI1640细胞培养基调整细胞浓度为106/ml，并加入台盼蓝染色活细胞>95%。取48孔培养板，每孔4×105个淋巴细胞，每孔给予PBS，5 μg/ml的H-AChR 或2 μg/ml的H-AChR γ亚单位蛋白抗原刺激，每标本设置3个复孔，每孔反应终体积为200 μl。置于培养箱中孵育96 h后(温度37 ℃，5%CO2)，收集上清液，严格根据ELISA试剂盒说明书操作步骤，检测上清液中γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、白细胞介素(interleukin，IL)- 2、IL- 6、IL- 10的含量，于波长为405 nm的酶标仪上获取各个样本的OD值，再根据各细胞因子标准品浓度绘制的标准曲线换算出每个样本细胞因子的浓度，结果以pg/ml表示[9]。

统计学处理采用SPSS 22.0统计软件包，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的计量资料以M(Q1，Q3)表示，组间比较采用秩和检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

小鼠的临床症状及oEAMG发病率第3次免疫后，50%以上H-AChR γ组小鼠单眼或双眼出现不同程度的上睑下垂症状，实验终止前，H-AChR γ组9只小鼠中8只(89%)有眼部症状，6只小鼠有完全上睑下垂症状，而E.coli组和CFA组无明显眼部表现，评分均为0分；H-AChR γ组眼部临床症状严重度中位评分为1.75 (1.63，1.88)分，明显高于E.coli组和CFA组(P均<0.001)。实验终止前，H-AChR γ组9只小鼠中6只(67%)小鼠有轻度的全身症状(1级)；3只(33%)没有明显全身症状，其中2只仅有眼部症状为单纯oMG，1只小鼠没有全身及眼部症状。其他两组没有全身肌力减退症状，评分均为0分。H-AChR γ组小鼠全身临床症状严重度中位评分为0.65 (0.55，0.80)分，明显高于E.coli组和CFA组(P均<0.001)。溴新斯的明试验可完全或部分改善上睑下垂和全身症状。

小鼠血清AChR-Ab水平第2次免疫后15 d，H-AChR γ组小鼠血清AChR-Ab水平为(1.48±0.83)nmol/L，明显高于CFA组的(0.08±0.08)nmol/L和E.coli组的(0.15±0.13)nmol/L(P均<0.001)。第2次免疫后45 d，H-AChR γ组小鼠血清AChR-Ab水平为(1.55±0.99)nmol/L，也明显高于CFA组的(0.09±0.10)nmol/L和E.coli组的(0.21±0.21)nmol/L(P均<0.001)。

各组培养上清液中Th1、Th2相关细胞因子水平比较H-AChR刺激的H-AChRγ组小鼠淋巴结及脾淋巴细胞体外培养上清液中IL- 2(F=73.079，P<0.001；F=80.276，P<0.001)和INF-γ水平(F=32.568，P<0.001；F=30.766，P<0.001)均明显高于E.coli组和CFA免疫组；IL- 6(F=0.983，P=0.388；F=1.809，P=0.185)和IL- 10水平(F=1.367，P=0.274；F=1.054，P=0.364)与E.coli组和CFA组差异无统计学意义(表1)。H-AChRγ刺激的H-AChRγ组小鼠淋巴结及脾淋巴细胞体外培养上清液中IL- 2(F=42.835，P<0.001；F=38.030，P<0.001)和INF-γ水平(F=76.332，P<0.001；F=34.865，P<0.001)均明显高于E.coli组和CFA免疫组；IL- 6(F=1.325，P=0.284；F=1.935，P=0.166)和IL- 10水平(F=0.908，P=0.417；F=1.189，P=0.322)与E.coli组和CFA组差异无统计学意义(表2)。

讨 论

MG被认为是一种经典的由抗体介导的自身免疫性疾病，而Th细胞因其能够辅助B细胞分化成为具有抗体分泌能力的浆细胞，故在MG的致病机制中扮演重要角色[10]。Th细胞及其分泌的细胞因子间存在着复杂而多向的信号关系，它们通过叠加、协同或者拮抗等方式发挥作用，影响着MG的发生与发展。目前普遍认为Th1、Th2细胞之间平衡关系的破坏可能导致MG的发生发展，而其分泌的细胞因子在其中发挥了重要作用[2- 3]。研究表明，Th1和Th2型细胞因子都能通过辅助B细胞诱导不同亚型的Ig抗体合成，但其生成的免疫球蛋白类型不同；Th1型细胞因子能辅助B细胞产生IgA、IgM、IgG2a等抗体，这些类型的抗体能够和补体有效结合并激活补体；Th2型细胞因子能辅助B细胞产生IgE、IgG1等类型的抗体，而这类抗体和补体相结合的能力很弱[11]。

表1 H-AChR刺激LN及SP体外培养淋巴细胞上清液中细胞因子水平比较(n=9，-±s，pg/ml)Table 1 Cytokine levels in supernatant after in vitro culture of lymphocytes after stimulation of LN and SP by H-AChR (n=9，-±s，pg/ml)

H-AChR：重组人乙酰胆碱受体；LN：淋巴结；SP：脾脏；CFA：完全弗氏佐剂；IL：白细胞介素；INF-γ：γ-干扰素

H-AChR：human acetylcholine receptor；LN：lymph nodes；SP：spleen；CFA：complete Freund’s adjuvant；IL：interleukin；INF-γ：interferon-γ

表2 H-AChRγ刺激LN及SP体外培养淋巴细胞上清液中细胞因子水平比较(n=9，-±s，pg/ml)Table 2 Cytokine levels in after in vitro culture of lymphocytes after stimulation of LN and SP by H-AChR γ(n=9，-±s，pg/ml)

H-AChRγ：重组人乙酰胆碱受体γ亚单位

H-AChRγ：human acetylcholine receptor γ subuit

Th1细胞分泌的细胞因子IL- 2、IFN-γ是MG和EAMG的中心效应分子[12]。IL- 2最初被认为是T细胞生长因子，但近期研究表明其在体内的主要功能是维持免疫耐受，并且对于CD4+Foxp3+调节性T细胞的发育和功能不可或缺，是自身免疫调节的重要参与者[13]。IL- 2虽然不能直接诱导抗体的产生，但却可以通过与复杂的细胞因子网络中的某些关键细胞因子作用而参与MG和EAMG的发生、发展过程[14]。MG患者血清可溶性IL- 2受体水平明显增高，并与MG的临床类型、病情、预后等密切相关[15]。Liu等[16]通过向EAMG小鼠体内注射IL- 2/抗IL- 2mAb免疫复合体，能够诱导调节性T细胞持续扩增，从而有效抑制自身反应性T细胞、B细胞对AChR的反应，减轻MG的肌无力症状，提示IL- 2/抗-IL- 2mAb免疫复合物在MG治疗中可能具有潜在的临床应用价值。IFN-γ主要由活化的Th1细胞产生，具有多种免疫调节功能，在MG的发病过程中起到重要作用[17]。Tüzün等[18]在一项前瞻性研究中发现，经治疗后好转的MG患者体内IFN-γ水平升高，且IFN-γ水平与患者治疗后临床评分之间存在直接相关性。此外，IFN-γ能够通过上调MHC-Ⅱ类分子基因表达，活化Th1和Th2细胞，并促进B淋巴细胞成熟而诱导AChR-Ab的产生，它还通过影响体内外自身抗原AChR的表达，启动自身免疫性抗AChR反应的发生和发展[19]。Huang等[20]研究发现，IFN-γ能够诱导MG患者体内CD4(+)CD25(-)T细胞向具有免疫抑制功能的CD4(+)CD25(+)T细胞转化，从一个新的角度揭示了IFN-γ在MG发病机制中的重要作用。

Th2细胞分泌的细胞因子IL- 6、IL- 10，主要刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫应答相关[21]。IL- 6在B细胞增殖和分化过程中起调节作用，主要直接影响成熟的B细胞产生IgM、IgG、IgA，亦可诱导T淋巴细胞的活化、增殖和分裂。Aricha等[22]发现IL- 6能够抑制Th17细胞相关基因在EAMG小鼠体内的高表达，提示IL- 6可能在自身免疫反应调控中起到重要作用，也从一方面说明了IL- 6在MG发病中起促进作用。IL- 10是一种具有多向调节功能的细胞因子，其不仅能够抑制Th1介导的免疫应答，同时还可以促进B细胞增殖、分化和体液免疫应答[23]。研究发现，MG患者血清IL- 10水平显著升高，且经血浆置换治疗后其水平仍高于正常基线，提示IL- 10可能在MG的致病机制及病程的迁延中起到关键作用[24]。Sheng等[25]在动物实验中同样证实IL- 10在EAMG小鼠的免疫调节中起到重要作用，其能够促进调节性T细胞和调节性B细胞的增殖。Alseth等[26]分析了64例 MG患者和87例健康志愿者中IL- 10基因启动子区域的位置分布，发现IL- 10基因多态性与MG的易感性及严重程度存在紧密联系。此外，有研究发现MG患者体内B细胞能够产生较低水平的IL- 6、IL- 10和肿瘤坏死因子-α，且这些细胞因子的水平不受免疫抑制治疗的影响，提示这些B细胞衍生的细胞因子可能在MG的致病机制发挥重要作用[27]。

本研究利用重组H-AChR γ亚单位免疫HLA-DQ8转基因小鼠建立oEAMG模型，并从临床表现、血清AChR-Ab滴度升高等方面证实建模成功。通过ELISA检测淋巴细胞体外培养上清液中细胞因子浓度发现，H-AChR γ亚单位免疫组小鼠淋巴细胞体外培养上清液中Th1型细胞因子IL- 2、INF-γ水平与对照组相比显著增高，而Th2型细胞因子IL- 6、IL- 10水平则无明显差异。推测Th1细胞介导的细胞免疫在oEAMG的发病初期反应强烈，同时IL- 2和INF-γ作为重要效应因子参与oEAMG的发病过程，并可能较早参与B淋巴细胞的激活，通过细胞和抗体介导途径促进了oEAMG的启始。Th2细胞及其细胞因子在oEAMG的发病机制中的作用尚不十分明确，也可能被活跃的Th1反应系统所掩盖。