MicroRNA-17通过调节MMP-2影响滋养层细胞的侵袭与迁移

黄志蓉 陈育娟

（厦门大学附属妇女儿童医院，厦门市妇幼保健院围产保健科，福建 厦门 361003）

妊娠期高血压疾病是妊娠与血压升高并存的一组疾病[1]。这些疾病几乎占所有孕产妇死亡的10%。有研究发现，胎盘滋养层细胞的过度迁移和侵袭与妊娠高血压的发生紧密关联[2]。

MicroRNA（miRNA）是一类由19-24个核苷酸组成的小非编码RNA，并参与许多基本的细胞过程[3]。已有多项研究发现miRNAs参与妊娠期高血压疾病发生与发展[4]。约有600个miRNA在人类正常胎盘和惊厥前期胎盘中表达，其中miR-17被发现在重度子痫前期患者胎盘中表达降低[5]，提示miR-17可能参与滋养细胞侵袭、迁移等功能异常过程，但具体分子机制仍需不清楚。本实验通过上调及下调滋养层细胞HTR8-SVneo内miR-17的表达水平，检测滋养层细胞迁移和侵袭功能变化，并检测其对基质金属蛋白酶-2（MMP-2）蛋白表达的影响，探讨miR-17和MMP-2在滋养细胞的侵袭和迁移能力中的作用，为临床妊娠高血压的靶点治疗提供有力的实验室依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系：人类滋养层细胞系HTR8-SVneo由本实验室保存。

1.2 细胞培养：HTR8-SVneo细胞培养于含有10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及链霉素100 μg/mL的DMEM培养基（美国Gibco公司）中。培养瓶置于37 ℃，5% CO2培养箱，每2～ 3 d进行一次细胞传代。

1.3 细胞转染：通过细胞转染将miR-17 mimic或miR-17 inhibitor或pcDNA-MMP2（上海吉玛基因）转染至HTR8-SVneo细胞。具体过程为，接种于6孔板的HTR8-SVneo细胞生长至50%～70%密度时，用Lipfectamine 3000将上述RNA或DNA转染至细胞，24 h或48 h后提取RNA或蛋白进行后续实验。

1.4 荧光定量RT-PCR检测基因表达：提取HTR8-SVneo细胞中总RNA，经RNA浓度测定后，通过逆转录试剂盒，以总RNA为模板，将其逆转录为cDNA。以U6或磷酸甘油醛脱氢酶分子为内参，采用SYBR Green PCR试剂盒进行实时定量PCR检测miR-17或MMP-2表达水平。根据2-ΔΔCt方法计算相对表达水平，实验重复3次。

1.5 Western blot检测蛋白表达量：提取HTR8-SVneo细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，取等量蛋白加入SDS-PAGE胶孔中，待蛋白条带分离后，用孔径0.45 μm的PVDF膜进行蛋白转膜。TBST漂洗3次，用封闭血清封闭1 h，以1∶1000浓度加入兔（鼠）抗人MMP-2一抗或抗β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，常温下TBST洗膜3次，辣根过氧化物酶标记二抗孵育后ECL化学发光法检测，Quantity one软件分析。

1.6 Transwell侵袭实验：为消除细胞增殖对细胞侵袭实验的影响，HTR8-SVneo细胞经过血清饥饿后，羟基脲作用12 h，待转染不同RNA或质粒后，配制细胞悬液并计数（5×104个/mL）。向铺有Matrigel基质胶的Transwell上室（0.8 μm）加入200 μL细胞悬液，下室加入含有10% FBS的培养液500 μL，培养12 h。以棉签擦去上层未穿透膜的细胞，取下Transwell上室，用多聚甲醛室温固定5 min，2 μg/mL的DAPI染核，荧光显微镜每组随机取5个视野观察计数并记录穿膜细胞数。

1.7 划痕实验：为消除细胞增殖对细胞侵袭实验的影响，HTR8-SVneo细胞经过血清饥饿后，羟基脲作用12 h。将细胞分组转染不同RNA或质粒后，用100 μL枪头垂直孔板划线，弃细胞培养液，PBS冲洗孔板3次，继续在细胞培养箱中培养，拍照记录培0 h和24 h的细胞图片。

1.8 双荧光素酶实验：通过NCBI查询MMP-2基因3'-UTR序列后，设计合成其野生序列和突变序列，以pmirGLO质粒为载体，分别构建含有MMP-2 3'-UTR和MMP-2 3'-UTR突变序列的质粒，然后与miR-17 mimic或mimic-NC通过Lipfectamine 3000共转染至HTR8-SVneo细胞，48 h后用荧光检测仪检测荧光强度，每组试验重复3次。

1.9 统计学处理：用SPSS 20.0软件进行数据分析。实验数据用均数±标准差表示，两组均数间比较用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析和LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 转染后miR-17的表达情况：荧光定量PCR检测转染miR-17 mimic或miR-17 inhibitor后HTR8-SVneo细胞中miR-17水平。结果见图1，与mimic-NC组相比，miR-17 mimic组中miR-17水平显著增加，而转染miR-17 inhibitor显著下调HTR8-SVneo细胞中miR-17水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 转染后miR-17的表达情况。*P＜0.05

2.2 miR-17对HTR8-SVneo细胞迁移和侵袭的影响：Transwell侵袭实验结果显示：转染miR-17mimic后，HTR8-SVneo细胞侵袭能力显著下降，而转染miR-17 inhibitor后细胞侵袭能力较对照组显著升高（P＜0.05）（图2）。

细胞划痕实验结果显示：转染miR-17mimic细胞的迁移能力较对照组显著降低，而miR-17 inhibitor显著增加细胞的迁移能力（P＜0.05）（图2）。

图2 miR-17对HTR8-SVneo细胞迁移和侵袭的影响。*P＜0.05

2.3 HTR8-SVneo细胞中miR-17调节MMP-2的表达：荧光定量PCR和Western blot检测miR-17对MMP-2的表达影响。结果显示，miR-17 mimic显著降低MMP-2的mRNA水平和蛋白水平，而miR-17 inhibitor显著提高MMP-2的mRNA水平和蛋白水平（图3）。经生物在线预测软件分析显示，miR-17与MMP-2 3'UTR具有潜在结合位点。为进一步确认miR-17与MMP-2的相互关系，开展双荧光素酶实验。结果显示，miR-17 mimic可降低含有MMP-2 3'UTR序列的荧光素酶报告质粒所在细胞的荧光素酶活性，而对含有MMP-2 3'UTR突变序列的荧光素酶报告质粒所在细胞的荧光素酶活性没有影响（图3）。

图3 miR-17调节MMP-2的表达。*P＜0.05

2.4 MMP-2逆转miR-17对HTR8-SVneo细胞迁移和侵袭的抑制作用：HTR8-SVneo细胞转染miR-17 mimic或转染miR-17 mimic和pcDNAMMP-2组。Transwell侵袭实验和划痕实验结果显示，miR-17 mimic显著抑制HTR8-SVneo细胞侵袭和迁移，而pcDNA-MMP-2逆转miR-17 mimic的抑制作用（图4）。

3 讨 论

胎盘外滋养层细胞向母体子宫组织迁移是胎盘成功植入和胎儿结局的基础。妊娠早期滋养细胞开始侵袭过程，并持续到妊娠第二十周。在最初的几周内，迁移到母体螺旋动脉的血管内滋养细胞会堵塞这些血管，这可能会阻止母体血液过早进入绒毛间腔。滋养细胞的异常侵袭、血管的不完全阻塞和氧气水平的过早升高会损害胎盘绒毛，从而导致妊娠并发症的发生，如流产、妊娠期高血压等[6]。最近研究表明，miRNA是滋养细胞侵袭和迁移的一种新的调节因子[7]。有研究报道，人类胎盘中表达大量miRNA，且miRNA表达谱在妊娠高血压患者和正常人胎盘中存在差异[8]。如Gao等研究发现miR-299通过靶向组蛋白脱乙酰酶2抑制子痫前期滋养细胞的侵袭和迁移。Xu等的实验发现，与正常对照相比，miR-17在严重子痫前期患者胎盘中表达显著下降[5]。为研究miR-17在滋养层细胞中的作用，在滋养层细胞中促进miR-17表达或抑制miR-17表达，检测滋养层细胞迁移和侵袭的变化。结果发现，过表达miR-17会抑制HTR8-SVneo细胞迁移和侵袭，揭示miR-17可能在滋养层细胞功能中发挥重要作用。

图4 MMP-2与miR-17对HTR8-SVneo细胞迁移和侵袭的抑制作用的关系。*P＜0.05；#P＜0.05

近年来研究表明，MMP-2是MMP超家族中一种重要的锌依赖蛋白酶，可分解细胞外基质复合物，可能参与胚胎发育过程中细胞滋养层的侵袭。MMP-2表达失调和MMP-2活性降低参与了妊娠期高血压患者子宫胎盘异常重构和滋养细胞侵袭。MMP-2的下调与炎症和氧化因子共同导致子痫前期滋养细胞功能障碍。研究发现，miR-29b通过靶向MMP-2和血管内皮生长因子A抑制滋养细胞的侵袭和血管生成，增强细胞凋亡。通过生物在线预测软件及双荧光素酶报告基因实验，发现miR-17可抑制MMP-2的表达，且二者存在相互作用。进一步研究发现，MMP-2逆转miR-17对滋养层细胞迁移和侵袭的抑制作用。

本实验发现miR-17可抑制HTR8-SVneo细胞的迁移侵袭，进一步研究发现其是通过靶向抑制MMP-2表达，该结果为妊娠高血压的诊治提供新的思路。