TBX18腺病毒使成鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

李艳君，唐艳红，陈元秀，杨媚

干细胞特指具有自我更新和分化能力的细胞集，以干细胞为基础的治疗方法在过去15年获得了广泛关注[1]。骨髓腔由造血细胞及间充质干细胞等多相细胞群组成，其中，间充质干细胞(MSCs)是多能干细胞，可以在体内和体外分化成多种细胞类型，且较易从骨髓中获取，并进行培养和扩增[2-4]。T-BOX转录因子在胚胎期心脏细胞特异性的形成过程中起重要作用，已有研究证实，TBX18转录因子能诱导乳鼠心肌细胞分化为起搏样细胞，并特异性表达起搏细胞的特有标志物[5]。但是TBX18能否诱使成鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为心肌样细胞，仍未可知。本文旨在研究TBX18转录因子能否成功转入BMSCs，并诱导其向心肌样细胞分化，以期更好地指导临床，报道如下。

1 材料与方法

本实验于2015年5月—2016年10月在武汉大学心血管病研究所/心血管病湖北省重点实验室进行。

1.1 材料

1.1.1 实验动物： 成年SD大鼠，雄性，SPF级，体质量160～200 g，由武汉大学动物实验中心提供[动物许可证号：SCXK(鄂)2014-0004]。

1.1.2 试剂： 胎牛血清(FBS)、低糖DMEM(L-DMEM)培养基(Gibco公司)，兔抗α-SMA单克隆抗体、鼠抗cTnI单克隆抗体(Abcam公司)，重组腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP-TBX18 和pHBAd-MCMV-GFP(上海汉恒生物科技有限公司)，Alexa Fluor 647共轭的仓鼠抗大鼠CD29抗体、PE-Cy7共轭的小鼠抗大鼠CD90抗体、FITC共轭的小鼠抗大鼠CD45抗体、Alexa Fluor 647共轭的仓鼠IgM同型抗体、PE-Cy7共轭的小鼠IgG1同型抗体、FITC共轭的小鼠IgG1同型抗体(美国BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs分离培养及鉴定: 将大鼠麻醉，脱颈处死，用75%酒精浸泡5～10 min；于无菌操作台中取出股骨和胫骨，PBS加2%双抗清洗3～5次，尽量去除表面附着的软组织。剪掉两端干骺端，暴露骨髓腔，用5 ml注射器吸取10 %L-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白为止。将收集的悬液接种于10 cm的培养皿中，再转移至37℃、5% CO2培养恒温培养箱中。48 h后首次换液，以后每2～3 d换一次液，当细胞融合至80%～85%时，用0.25 %胰酶(不含EDTA)进行消化传代。取第3～5代细胞制成1×105/L 的细胞悬液，分别加入Alexa Fluor 647共轭的仓鼠抗大鼠CD29抗体、PE-Cy7TM共轭的小鼠抗大鼠CD90抗体、FITC共轭的小鼠抗大鼠CD45抗体，同时设立相应的同型阴性对照组，即Alexa Fluor 647共轭的仓鼠IgM同型抗体、PE-Cy7TM共轭的小鼠IgG1同型抗体、FITC共轭的小鼠IgG1同型抗体，流式细胞术鉴定BMSCs表面标志物及纯度，随机数字表法分为实验组(TBX18组)、空白病毒对照组(GFP组)和空白对照组(B组)。

1.2.2 人TBX18(hTBX18)腺病毒载体的构建及扩增： BamHI和NotI双酶切回收腺病毒骨架载体pHBAd-MCMV-GFP，PCR扩增TBX18 ORF序列，将处理好的目的片段与载体连接，得到重组腺病毒质粒pHBAd-MCMV-GFP-TBX18。将pHBAd-MCMV-GFP-TBX18转化DH5a感受态菌株，将转化后的TBX18平板挑菌，提取质粒后酶切鉴定，用293细胞进行扩增，直至获得大量纯化的TBX18腺病毒载体。

1.2.3 TBX18及GFP腺病毒的转染： 取第3～5代BMSCs接种于6孔板内，待细胞融合至50%～70%时，按感染复数即MOI=20、50、80、100分别加入TBX18或GFP重组腺病毒载体，以不含血清的L-DMEM培养基定容至1 ml，于CO2培养箱中培养。2 h后将病毒悬液吸出，再加入完全培养基2 ml，分别于 24 h及48 h后荧光显微镜下观察，均以不引起明显细胞病变效应的最大MOI值为合适的感染复数。经过不断尝试，确定本实验的最适MOI=100。

1.2.4 qRT-PCR检测α-SMA mRNA的表达： 转病毒后1周，用Trizol试剂提取各组BMSCs的总量RNA，按逆转录试剂盒说明书将其逆转录成cDNA，然后行荧光定量PCR (qRT-PCR)检查，反应程序：95 ℃预变性1 min，95℃变性15 s，58 ℃退火20 s，最后72 ℃延伸20 s，共循环40次。引物序列：α-SMA：5′-GAGCACGGCATTATCACCAAC-3′，5′-CAGAACAATGCCTGT GGTTCTC-3′；GAPDH：5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，5′-TTGCTGACAATC TTGAGGGA G-3′，以GAPDH作为内参，用2-△△Ct法进行定量分析。

1.2.5 Western blot检测α-SMA和cTnI蛋白的表达： 转病毒后1周，提取3组细胞的总蛋白，冰浴30 min，期间用移液器反复吹打，12 000 g离心5 min，收集上清液，即为总蛋白溶液。使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒来测定各孔蛋白浓度，每孔约加入蛋白40 μg，SDS-PAGE电泳分离蛋白后，转到PVDF膜上，兔抗α-SMA单克隆抗体(1∶3 000)、鼠抗cTnI单克隆抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜，再加入相应的HRP标记的二抗(1∶10 000)室温下孵育30 min，TBST冲洗4次。用AlphaEaseFC 软件处理系统分析相对应的光密度值，以GAPDH为内参作相对定量分析。

2 结 果

2.1 BMSCs的形态学特征及鉴定 细胞接种于培养皿后，呈圆形，大小不一；6～8 h后开始贴壁，呈圆形、多角形或梭形；48 h后细胞贴壁完成，呈三角形或梭形；7～10 d 形成细胞集落，呈均一的纺锤形；随着传代次数增加，杂细胞越来越少，骨髓干细胞越来越梭，同向排列，呈漩涡状或放射状。转病毒后24 h 和48 h，荧光显微镜下观察细胞转染，TBX18组和GFP组因含绿色荧光蛋白而呈绿色，BMSCs转染效率较高，可达95%～96%(图1见封3)。流式细胞术结果表明：培养的细胞表达干细胞标志物CD29和CD90，几乎不表达造血干细胞标志物CD45，表明通过此法获得的细胞是较纯净的BMSCs(97%～99%)，见图2。

2.2 qRT-PCR检测α-SMA mRNA的表达 转染后1周，检测各组α-SMA mRNA的表达，结果提示：TBX18 组的α-SMA mRNA(2.66±0.08)表达水平明显高于GFP组(1.49±0.09)和B组(1.00±0.00)，差异均有统计学意义(t=16.743、36.813，P=0.000、0.000)，见图3。

注：T.TBX18组；G.GFP组；B.B组。与G组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05

2.3 Western blot检测α-SMA和cTnI蛋白的表达 Western blot法检测各组相对光密度值结果显示：TBX18 组α-SMA蛋白的表达(0.66±0.00)明显高于GFP组(0.36±0.08)和B组(0.17±0.03)，差异均有统计学意义(t=6.751、23.761、P=0.003、0.000)；cTnI蛋白的表达(0.57±0.12)明显高于GFP组(0.32±0.04)和B组(0.09±0.00)，差异均有统计学意义(t=3.298、6.660、P=0.030、0.003)，见图4。

注：T.BX18组；G.GFP组；B.B组。与G组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05

3 讨 论

BMSCs是骨髓中的非造血干细胞，在治疗心血管疾病时，BMSCs是以细胞为基础的再生疗法的首选供体，因为这类细胞具有诸多优势，包括易获得，便于增殖，低免疫原性，易于导入外源基因和进行基因修饰等[6-8]。尽管目前可选的方法有很多，但移植干细胞直接分化成为心肌细胞，仍然是心脏再生治疗的一大挑战。突出强调研究这个至关重要的细胞分化过程和研发新的改善心脏再生治疗方案的重要性和紧迫性[9-10]。

尽管对BMSCs的生物化学特征和免疫组织化学特征进行了众多研究，仍然没有重要的参数来鉴别和描述这些干细胞[11-13]。从理论上来讲，这些参数应包括细胞增殖速度、免疫表型标志物、细胞活性和表型细微结构等[14]。体外用于鉴别BMSCs的方法，多采用分析细胞表面标志物的表达，如CD90、CD29、CD44和CD106，其中应用较多的当属CD29及CD90[15]。经研究证实，CD90和CD29是干细胞的典型标志物，CD45是淋巴造血细胞的表面标志物。在本实验中，BMSCs 的表面标志物CD90和CD29的阳性率为97%～99%，几乎看不到CD45的表达，由此足以说明，全骨髓贴壁法可分离获得较为纯净的BMSCs。

图2 流式细胞术检测BMSCs表面标志物的表达

TBX18是转录因子 T-box 家族中的一员，位于染色体6q14-q15，是新的祖细胞标志因子之一，也是胚胎发育期的重要转录因子[16-17]。TBX18在心包膜、心外膜、间充质祖细胞、窦静脉区的分化心肌细胞中表达，可形成窦角和窦房结心肌细胞，但不形成心房和肺静脉心肌细胞[18]。经研究证实，TBX18阳性的心外膜细胞可形成室间隔和左心室心肌细胞[19]。以TBX18为基础的基因家族分析也表明，心外膜细胞直接形成心脏的成纤维细胞和平滑肌细胞系[20-21]。那么单一的转录因子TBX18能否使BMSCs分化为心肌细胞呢？基于此，本文构建了TBX18腺病毒载体，转染成年大鼠BMSCs，经过不断测试，确定最佳MOI=100，此时荧光表达较亮，转染效率高，死细胞少，且将此滴度用于后续实验，病毒转染后再继续培养1周，用分子生物学方法检测心肌相关标志物的表达，即α-SMA和cTnI的表达。

Ca2+通过2种特有的调节蛋白，即肌钙蛋白和原肌球蛋白，以调控椎横纹肌的肌动蛋白(Tn)及肌球蛋白(Tm)的收缩，Tn和Tm均位于细肌丝[22]。其中，Tn由3个亚基组成，即肌钙蛋白C(TnC)，肌钙蛋白T(TnT)和肌钙蛋白I(TnI)，cTnI在心脏中具有较高的特异性，且参与调控肌肉收缩，主要分布于骨骼肌细胞和心肌细胞中，几乎不存在于平滑肌细胞，因此，cTnI是鉴别心肌细胞的特有蛋白[23]。α-SMA常被用作鉴别心肌细胞，兔抗α-SMA单克隆抗体是专门用来鉴别α-骨骼肌和α-心肌辅肌动蛋白，诱导分化的心肌细胞具有心脏肌小节，与α-SMA抗体起作用[24]。本结果提示：TBX18转染诱导BMSCs形成的细胞，可表达心肌细胞的特有标志物，即α-SMA和cTnI，表明单一的转录因子TBX18能诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。此结果是可喜的，但转化率依然不是很高，如何高效地诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，依然是一个亟待解决的问题[25-26]。那么TBX18转录因子能否使骨髓间充质干细胞分化为起搏样细胞呢？这也为我们下一步的研究方向提供了新的思路。

利益冲突：无

作者贡献声明

李艳君：负责实施研究过程，撰写论文；唐艳红、陈元秀：论文修改、审核；杨媚：提出研究思路，指导实验过程