尿液RBP和ALB在早期糖尿病肾病中的诊断价值及其与外周血MCP-1表达的关系

蒙军平，张涵，赵洁，孙脊峰

随着人口老龄化以及人们生活饮食习惯的改变，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的发病率逐渐升高，DM是由于机体不同发病机制以及复合病因所引起胰岛素相对或者绝对不足，从而造成患者葡萄糖、脂肪以及蛋白质发生代谢异常[1]。随着医疗技术的发展，急性DM相关并发症已得到一定程度的控制，患者生活质量得到提高，而以糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)为代表的慢性代谢性疾病的临床诊治效果较差[2]。DN是目前临床上最为常见的DM并发症之一，占30%～35%，以渐进性以及慢性损伤为主要特征[3]。早期一般无典型的相关症状出现，可出现高血压或者血压无明显变化，早期DM患者会出现肾体积增大，渐渐出现高滤过现象，进而导致微量蛋白尿以及间歇性蛋白尿的出现，另外持续性的高血压、水肿以及蛋白尿会随着患者病程的延长逐渐出现，从而造成肾功能不全[4]。由于DN早期无特异性症状，容易疏忽漏诊，病情逐渐发展，危及患者生命健康，如能在其早期及时确诊，并给予针对性的治疗，可及时控制病情[5]。目前临床上的DN诊断指标大都采用尿白蛋白排泄率，但由于其在糖尿病肾病早期无明显异常表现，诊断敏感度和特异度较低，故寻找相对可靠的DN诊断指标显得尤为重要。白蛋白(ALB)是肾小球微血管病变较为敏感的指标，可有效反映蛋白质在肾脏中的异常排泄；视黄醇结合蛋白(RBP)是反映患者肾小管损伤的敏感性指标，对早期DN的诊断具有一定临床意义。又由于DN的发病与单核细胞超化蛋白(MCP-1)等细胞炎性因子有着密切关系，故笔者分析尿液RBP、ALB在早期糖尿病肾病中的诊断价值及与外周血MCP-1表达关系，为其临床诊断提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年9月—2017年12月空军军医大学唐都医院肾脏内科收治的2型糖尿病患者86例作为研究对象，按照患者24 h 尿蛋白排泄率(urinary albumin excretion，UAER)进行分组，UAER﹤30 mg/24 h为单纯DM组(46例)，30～300 mg/24 h为早期DN组(40例，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期15例，Ⅲ期13例)。单纯DM组：男25例，女21例，年龄35～70(46.3±4.6)岁；平均病程(3.2±0.7)年；合并有高血压22例，蛋白尿15例，腓肠肌痉挛10例。早期DN组：男22例，女18例，年龄36～70(45.8±5.1)岁；平均病程(3.4±0.9)年；合并有高血压19例，蛋白尿13例，腓肠肌痉挛8例。并取同期来医院体检的42例健康人(口服葡萄糖耐量试验结果正常者)作为健康对照组，其中男22例，女20例，年龄35～68(46.1±4.8)岁。3组受试者的性别、年龄等比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者及家属同意并积极配合本研究并签署知情协议书。

1.2 选择标准 诊断标准：(1)2型糖尿病诊断标准[6]：符合美国糖尿病协会(ADA)于2010年制定的标准，患者空腹血糖(8 h内无热量摄入)≥7.0 mmol/L；伴有典型的高血糖以及高血糖危象症状者，随机测定血糖≥11 mmol/L；2 h耐糖试验显示，血糖≥11 mmol/L；糖化血红蛋白≥6.5%者；(2)早期糖尿病肾病分期标准[5]：Ⅰ期主要以患者肾体积以及肾小球的滤过率增加为主要特征，可经过治疗逐渐恢复，无相关组织病理学损伤；Ⅱ期为患者肾小球出现病理性病变，系膜区基质增多，GBM增厚，但尿白蛋白排除率正常；Ⅲ期即为早期糖尿病肾病。纳入标准：(1)年龄在35～70岁，符合上述诊断标准者；(2)近期无严重感染者；(3)无其他相关原因造成的肾脏等相关泌尿系统疾病者；(4)无相关家族遗传史。排除标准：(1)合并有免疫系统疾病者；(2)近期有肾毒性相关性药物服用史者；(3)合并有心肝肾等严重疾病者；(4)依从性差，中途退出者。

1.3 观测指标与方法 (1)尿液RBP、ALB测定[7]：取受试者晨尿10 ml，采用医用离心机(河北鑫乐科技有限公司)以3 000 r/min速度离心10 min，取其上清液，采用免疫透射比浊法测定，试剂盒均购于上海北加生化试剂有限公司，操作方法严格按照说明书进行。阳性率判定： ALB阳性>30 mg/L，RBP阳性>50 mg/L。(2)MCP-1表达[8]：抽取受试者空腹肘静脉血5ml置于抗凝管备用，1.25 μl被PE标记为鼠抗人MCP-1单抗(上海广锐生物科技有限公司)和2.5 μl被PE-Cy5标记的鼠抗人CDl4单抗(上海信裕生物科技有限公司)分别加入到检测管中，MCP-1单抗相应的鼠抗人IgG单克隆抗体(上海科敏生物科技有限公司)和2.5 μl的PE-Cy5标记的鼠抗人CDl4单抗加入到对照管中，然后分别向其中加入肝素(江苏万邦生化医药股份有限公司生产)100 μl进行抗凝处理。上述样品避光放置20 min，之后分别向其中加入溶血剂2 ml，在室温下放置10 min，采用医用离心机 1 500 r/min离心5 min，舍弃离心管中的上清液，向其中加入磷酸盐缓冲液(PBS)2 ml进行重悬处理，再次重复上述离心处理，之后采用上述PBS缓冲液冲洗3遍，舍弃离心管中的上清液，选用生理盐水500 μl进行混匀，采用流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)进行MCP-1表达的测定。

2 结 果

2.1 3组尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1变化比较 患者尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1水平早期DN组>单纯DM组>健康对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 3组受试者尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1变化比较

2.2 不同DN分期患者尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1变化比较 患者尿液RBP、ALB及外周血MCP-1水平比较，Ⅲ期>Ⅱ期>Ⅰ期，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.3 尿液RBP、ALB及RBP+ ALB联合诊断早期DN的ROC分析 尿RBP、ALB及RBP+ ALB联合诊断早期DN的曲线下面积分别为0.720、0.743、0.982，同时RBP+ ALB联合诊断、敏感度以及特异度明显较高。见图1、表3。

2.4 RBP、ALB以及RBP+ ALB联合诊断的阳性率比较 RBP和ALB单独诊断早期DN的阳性率均为67.44%(58/86)，而RBP+ALB联合诊断的阳性率为88.37%(76/86)，三者比较差异具有统计学意义(χ2=10.944，P=0.001)。

2.5 相关性分析 糖尿病肾病患者的尿液RBP和ALB与外周血MCP-1表达均呈正相关(r=0.457、0.483，P=0.000、0.032)。

表2 不同DN分期尿液RBP、ALB水平以及外周血MCP-1变化比较

图1 尿RBP、ALB及联合诊断早期DN的ROC曲线下面积

表3 尿RBP、ALB及RBP+ ALB联合诊断的Cut-off值、敏感度以及特异度

3 讨 论

糖尿病肾病具有典型的病理性变化，表现为肾小球固有细胞及细胞外基质增殖，进而形成K-W结节、肾小球硬化，肾小管不同程度损伤及间质出现不同程度的纤维化，另外在其肾小球的基底膜也会发生增厚现象[9]。由于早期的糖尿病肾病患者进行尿常规检验时，一般出现蛋白阴性，同时又没有典型的临床特征，容易出现误诊漏诊现象，而一旦尿常规检验出现蛋白阳性，表明此时患者的肾脏已经受到了不可逆的损伤，常规血糖控制治疗难以控制病情的进一步恶化[10]。所以DN的早期发现，并给予针对性的治疗措施，可以及时控制病情，提高患者生存率，改善预后[11-13]。

ALB是由机体肝脏合成的一种带有负电荷的微量蛋白，相对分子质量不小于6 900，正常情况下，由于电荷屏障分子筛的屏障作用，ALB基本上难以通过肾脏的滤过进入尿液，所以生理条件下尿液中的ALB含量很低[14]。当DM患者长期受外界各种因素的影响，造成肾脏发生一定程度的损害，肾小球滤膜的电荷屏障以及机械屏障受损，此时会有部分ALB进入肾小球的滤液中，当肾脏受损到一定程度时，肾小球滤液中的ALB含量超过其阈值时，会使患者尿液中的ALB含量增加。诊断阳性率、灵敏度较高。另外，当肾小管出现功能损伤时，即使肾小球功能正常，肾脏的重吸收功能发生障碍，也会造成尿液中ALB含量升高。再者由于DN患者一般都是长期处于低水平胰岛素以及高血糖的内环境下，可以显著降低肾脏中的硫酸肝素糖蛋白的含量，其主要存在于肾小球基底膜内外的疏松层中，从而减少负电荷含量，进而提高尿中ALB的含量[15-16]。健康人尿中ALB的含量一般不超过20 mg/L，含量20～200 mg/L即称为ALB尿，研究显示其可以作为早期DN的诊断指标。

本结果显示，早期DN患者的尿ALB含量最高。RBP是由患者肝细胞内质网合成的一种亲脂性蛋白质，主要分布在尿液、脑脊液以及血清中，在血液中起到一定程度的维生素转运作用，相对分子质量在21 000左右[17]。血液中以游离状态存在的RBP可以被机体的肾小球滤出，并很快在肾脏的近曲小管部位分解[18]。当患者肾脏的滤过功能受损，超过阈值后，尿液中RBP含量升高，可以相对灵敏地反映患者近曲小管的早期损伤[19-21]。 本结果显示，2种指标单独诊断DN时，其诊断准确率无明显差异，而2种指标联合诊断时，可以一定程度避免其他因素引起的单一ALB或者RBP水平升高所引起的漏诊，可以全面的反映患者肾脏肾小管、肾小球以及近曲小管的早期损伤，诊断阳性率、灵敏度均较高。另外ROC曲线下面积越大诊断早期DN价值越大，RBP+ALB联合诊断的敏感度以及特异度均明显较高，故RBP+ ALB具有更好的临床诊断价值。结果显示，DN的发病与炎性细胞在肾组织的浸润关系密切，而MCP-1是由成纤维细胞、单个核细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞以及肾小管上皮细胞分泌产生并在肾脏积聚活化，对DN的发生以及发展具有显著的介导作用，可以一定程度反映患者肾脏的早期损伤[22]。故其表达与尿液RBP、ALB水平呈现正相关。

综上所述，尿液RBP+ALB联合诊断早期糖尿病肾病的ROC曲线下面积较大，临床诊断价值较高，并与外周血MCP-1表达呈现正相关，可以较为灵敏地反映患者的肾功能损伤，有效地避免或者延缓糖尿病肾病的发生，提高患者的生活质量。

利益冲突：无

作者贡献声明

蒙军平：执笔，整理资料，分析资料；张涵：收集整理资料，分析数据，图表设计；赵洁：收集整理资料，参考书籍查找；孙脊峰：修改总指导