β-胡萝卜素胶体分散体系的制备及其显色特性

吴彬娴，林展拓，高志明,2，杨 楠,2，方亚鹏,2,*

（1.湖北工业大学 菲利普斯亲水胶体研究中心，湖北 武汉 430068；2.工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068）

β-胡萝卜素通常存在植物体和一些动物体内[1]，其分子式为C40H56，相对分子质量为536.88，由11 个共轭双键和2 个β-紫罗酮环组成，在食品中常作为色素使用[2]。但由于β-胡萝卜素自身不溶于水，并且对光、氧、热敏感，其在食品工业中的应用受到极大的限制[3-4]。

β-胡萝卜素的分子结构对其显色起着重要作用。其分子中的碳碳双键是一种发色团，当分子内有2 个或2 个以上的发色团共轭时，其对光的吸收波长可移到可见光区。另外，β-胡萝卜素的显色性也与其在食品中存在的颗粒大小、顺反异构体的含量以及晶型密切相关[5]。根据顺反异构的类型及含量不同，β-胡萝卜素可表现为黄色、橘色或红色，在波长400～500 nm处有最大吸收峰。相关研究表明，在胶体颗粒中，β-胡萝卜素有2 种存在形式，H型聚合体和J型聚合体[6-9]。单纯的H型聚合是由4 个β-胡萝卜素分子平行排列形成，这种排列形式的吸收光谱会发生约44 nm的蓝移；而J型聚合是指β-胡萝卜素分子呈人字形或首尾相连的排列聚集[10]，这种排列形式的吸收光谱会发生约44 nm的红移或7 nm的蓝移。另外，颗粒在体系中的粒径分布不同，导致颗粒在体系中对光的吸收和散射不同。当颗粒粒径（r）远小于光的波长时（2πr/λ＜＜1），光的散射符合瑞利散射，即光散射强度变小，颜色的亮度降低，随颗粒的粒径逐渐增大，色彩的饱和度会下降，颜色变暗[11-13]。随颗粒的粒径进一步增大（2πr/λ≥1），光的散射符合米氏散射，短波长的光发生散射，散射光的强度与光的波长之间的关系不再显著。体系的颜色主要受颗粒的比表面积和其对光的吸收影响。

食品体系实际上属于胶体体系，其具有多相、多组分、多尺度的特性。多数情况下，食品体系处于亚稳态，易发生聚集、沉降、絮凝等现象，并由此导致食品的颜色、质构、口感的变化[14-17]。本实验在亲水环境中制备不同粒径的β-胡萝卜素颗粒，研究不同粒径分散体系的吸光和显色性的区别。通过卡拉胶凝胶固化，使不同粒径的β-胡萝卜素颗粒分散体系得以稳态化，为其作为食品着色剂的应用提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-胡萝卜素（纯度93%） 浙江医药股份有限公司；Gelcarin GP-911NF κ-卡拉胶 美国FMC公司；吐温80（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

EL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；VCX800超声波细胞粉碎仪 美国Sonics公司；TU-1900型双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌水浴锅 巩义市予华仪器有限责任公司；JEM-2100（HR）透射电子显微镜 日本电子株式会社；PT-MR 2011型高速剪切乳化机 瑞士Kinematica公司；LGJ-12型冷冻干燥机 郑州宏朗仪器设备有限公司；CM3500d型色度仪 日本柯尼卡美能达公司；BT-1600型光学显微镜 丹东百特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-胡萝卜素的超声分散及表征

将质量分数0.1%的β-胡萝卜素粉末加入到质量分数0.5%的吐温80溶液中，冰水浴超声分散10 min，防止超声过热致使β-胡萝卜素降解。每隔1 min定时取样进行粒径分析和其他表征。超声功率设置为40%（总功率800 W），系统运行和间隔时间设置为1 s。

经超声分散的β-胡萝卜素胶体颗粒的形貌采用透射电子显微镜观察。将β-胡萝卜素分散液用去离子水稀释至0.05%，取10 μL稀释液滴于铜网上，待水分挥发后用质量分数3%磷钨酸溶液进行负染，挥干后在透射电子显微镜下观察。

取β-胡萝卜素分散液200 μL加4 800 μL去离子水稀释后于TU-1900型双光束紫外-可见分光光度计中进行全波段扫描以探究不同粒径β-胡萝卜素在体系中的特征吸收峰的区别。以不添加β-胡萝卜素的稀释液为空白对照，波长宽度1 nm，慢速扫描，波长范围为200～900 nm进行全波长扫描。

粒径在25 ℃条件下测量，取β-胡萝卜素分散液200 μL加4 800 μL去离子水后摇匀，吸取1 mL的稀释液于样品池中。每个样品测量3 次并取平均值。

1.3.2 β-胡萝卜素胶体分散体系的制备及表征

在85 ℃条件下将超声后的β-胡萝卜素分散液以体积比1∶10加入到不同质量分数（0.2%～1.2%）的卡拉胶溶液（含0.1 mol/L KCl）中混合均匀，然后置于冰水中冷却，以体系无法自由流动为准，直到体系完全凝固。采用高速剪切将含有β-胡萝卜素胶体颗粒的凝胶在2 000 r/min转速下剪切粉碎，使体系中无肉眼可见的大块凝胶以便冻干。经冻干后得到含有β-胡萝卜素的固体粉末，粉末主要由卡拉胶和β-胡萝卜素组成，且含有少量的KCl。

采用光学显微镜观察凝胶微观结构。将冻干后的β-胡萝卜素凝胶粉末分散于去离子水中，取少量分散液置于载玻片上进行微结构观察。

1.3.3 色值分析

将冻干后的β-胡萝卜素胶体分散体系的粉末复溶后在柯尼卡美能达CM3500d型色度仪上进行透射光谱和L*、a*、b*值测定。其中透射光谱测定波长范围为350～750 nm。运用D65观察视场下测定CIE色度空间中的色度坐标L*、a*、b*值和透光率。

1.3.4 稳定性分析

将冻干的胶体粉末复溶为1%的分散液置于室温条件下进行不避光、不除氧贮藏，每1 d测定β-胡萝卜素含量。取1 mL胶体分散液于离心管中，加入6 mL正己烷振荡萃取。静置待混合物分层后取上层清液在波长450 nm处测定吸光度。

1.4 数据处理与分析

实验数据采用Orign 8.0软件进行分析。通过BT-1600图像颗粒分析系统观察复溶后的胶体分散体系粉末。

2 结果与分析

2.1 超声对β-胡萝卜素胶体颗粒形貌的影响

如图1所示，超声时间为1 min时（图1A），β-胡萝卜素在吐温80溶液中呈块状，且颗粒形状各异、大小不一。但β-胡萝卜素晶体的微观特征清晰可见，呈现出细条状纹路。超声时间为5 min时（图1B），分散体系中大部分β-胡萝卜素呈均匀的球状颗粒，且粒径变小。而在水中超声5 min后（图1C）的β-胡萝卜素颗粒较大，且尺寸不一，在放置过程中颗粒极易聚集而产生沉降。说明超声能使β-胡萝卜素在水相中形成纳米颗粒，但由于较强的表面疏水性，这种颗粒在水相中容易发生聚集。而吐温80能与β-胡萝卜素颗粒间通过疏水相互作用从而有效阻止其疏水聚集[18]。

图1 超声处理后β-胡萝卜素颗粒的透射电子显微镜图Fig. 1 TEM of β-carotene particles after ultrasonication

2.2 超声对β-胡萝卜素胶体颗粒的粒径和显色性的影响

图2 不同超声时间β-胡萝卜素分散液粒径（A）、粒径分布（B）、外观（C）和紫外-可见全波段扫描（D）Fig. 2 Changes in particle size and color properties of β-carotene dispersions during ultrasonication

如图2A所示，随超声处理时间的延长，β-胡萝卜素的粒径逐渐减小，并在5 min后趋于稳定，此时的粒径约为（164±1）nm。从图2B可以看出，随着超声处理时间延长，β-胡萝卜素的粒径分布主峰由较大粒径向较小粒径方向逐渐移动，并在5 min后趋于稳定。与图2A所呈现的趋势一致。综合两图，β-胡萝卜素颗粒在超声处理5 min后其在水相中的分散性达到稳定。

如图2C所示，随着超声时间延长，β-胡萝卜素的外观颜色先逐渐由橙红色变为橙黄色（1～5 min），后随着超声时间的进一步延长，色泽变化不再明显（5～10 min）。

如图2D所示，所有样品均在330～350 nm处有最大吸收峰，此处吸收峰为β-胡萝卜素顺式异构体所致；随着超声处理时间延长，粒径变小，β-胡萝卜素特征吸收峰（400～500 nm）逐渐增高；535 nm为结晶型β-胡萝卜素的吸收峰。这可能是由于结晶型的β-胡萝卜素是以全反式异构体为主，而无定型的β-胡萝卜素以顺式异构体为主[19]。在本体系中，随粒径减小，β-胡萝卜素特征吸收峰（450 nm左右）出现蓝移。分散体系中颗粒的大小在一定程度上也可以影响体系的色泽，根据Kubelka-Munk[20-22]理论，当颗粒的粒径足够小时，光散射减小，体系的明亮程度也会降低。这也是超声导致色泽改变的原因之一。

2.3 卡拉胶质量分数对β-胡萝卜素分散体系稳定性的影响

图3 不同质量分数卡拉胶稳定的β-胡萝卜素分散颗粒凝胶、粉末及复溶后（A）和微观形貌（B）Fig. 3 Appearance (A) and microstructure (B) of β-carotene colloids stabilized with different concentrations of kappa-carrageenan

卡拉胶凝胶形成过程中，其分子之间通过交联而形成三维网络结构[23-27]。本研究利用这一原理，将超声形成的β-胡萝卜素颗粒固定在卡拉胶网络结构中，防止其发生进一步聚集沉降，从而实现稳态化。卡拉胶质量分数越高，其形成的三维网络结构越致密[23]，其对β-胡萝卜素的稳定能力有所不同。由图3A可知，卡拉胶质量分数在0.6%以下时，凝胶网络较为稀疏，β-胡萝卜素颗粒不能被很好地稳定，复溶前后颜色差别较大。当卡拉胶质量分数在0.8%以上时，β-胡萝卜素颗粒能够被较好地稳定。从图3B能够看出，卡拉胶质量分数较低时（＜0.6%），在静置的过程中β-胡萝卜素颗粒发生聚集和沉降，其在显微镜下表现为大块的β-胡萝卜素颗粒不均匀地分散于体系中。如图3B中箭头所指的黑色颗粒即为在静置过程中发生了聚集的β-胡萝卜素颗粒，当卡拉胶质量分数为0%时，视野中可见较大块的β-胡萝卜素颗粒；随着卡拉胶质量分数的增加，视野中可见的β-胡萝卜素颗粒逐渐变少。当卡拉胶质量分数较高（0.8%～1.2%）时，β-胡萝卜素颗粒均匀分散在凝胶体系中，未见明显聚集颗粒。同时，视野中可见半透明的卡拉胶凝胶，说明高质量分数卡拉胶凝胶对β-胡萝卜素颗粒具有较好的稳定效果。

2.4 β-胡萝卜素胶体分散体系的色值分析

图4 不同超声时间的胶体分散体系复溶后的色值分析Fig. 4 Color properties and appearance of re-dispersed β-carotene colloids

如图4A所示，在400～500 nm波长范围内，随超声时间延长（β-胡萝卜素颗粒粒径减小），胶体分散体系的分光透过率减小。说明在此波长范围内，体系对光的吸收随粒径减小而增大，这与全波长扫描图谱的结果一致。此外，随超声时间的延长，颗粒粒径减小，颗粒表面的分子数的比表面积增大，体系的透光率就会减小[22]。如图4B所示，体系的L*值随粒径的变小而变低，这可能是由于光散射强度随粒径减小而变小造成的。光散射强度越弱，体系对光的反射越弱，体系颜色更暗、颜色变深。同样通过a*、b*值可以发现，体系a*、b*值随粒径减小而增大，体系颜色向红光、黄光方向偏移。在图4C可以明显看出，体系的颜色逐渐由淡红变为橘红。这与β-胡萝卜素分散液（未被卡拉胶凝胶稳定时，图2C）的外观变化趋势一致。

2.5 β-胡萝卜素稳定性分析

图5 不同超声时间的胶体分散体系复溶后的贮藏稳定性Fig. 5 Stability of β-carotene dispersions with different ultrasonication times during storage

如图5所示，β-胡萝卜素胶体分散体系中β-胡萝卜素的降解速率随其粒径降低而加快。β-胡萝卜素的降解通常受诸多因素影响，如贮藏温度、pH值和离子强度等[28-29]。除此之外，与β-胡萝卜素所处体系的多孔性和水分活度也密切相关。当体系的孔隙较小，孔隙壁较薄时，β-胡萝卜素更易于暴露于更多的氧中，从而加速了β-胡萝卜素的降解[30]。本实验体系中采用了相同的卡拉胶凝胶稳定β-胡萝卜素颗粒，因此影响体系中β-胡萝卜素降解速率的因素主要为粒径。由于卡拉胶凝胶时形成了空间网状结构，离子和氧等可以较为自由地在体系中运动，且β-胡萝卜素比较均匀地分散在体系中，粒径较小的β-胡萝卜素颗粒比粒径较大的β-胡萝卜素颗粒具有更大的比表面积，小颗粒的β-胡萝卜素比大颗粒的β-胡萝卜素接触到更多的氧、离子和光，在贮藏的过程中，氧化更快。但在工业化应用的过程中，可适量添加抗氧化剂（如VC、VE）防止β-胡萝卜素的氧化。

3 结 论

本实验通过不同超声时间得到了不同粒径的β-胡萝卜素颗粒，并对其显色性进行了表征。进一步采用卡拉胶凝胶对β-胡萝卜素颗粒进行稳定，得到了适合添加至食品中的β-胡萝卜素胶体分散体系。随超声时间的延长，β-胡萝卜素颗粒的粒径减小，其颜色由红色向橘色转变，亮度降低。较高质量分数的卡拉胶凝胶（＞0.8%）能对β-胡萝卜素颗粒起到稳态化的效果。随着β-胡萝卜素颗粒粒径的减小，其在凝胶中的降解速率增加。本实验研究结果表明，食品体系的颜色不仅可以通过着色剂的种类、浓度来改变，也可以通过对着色剂的形态、粒径的调控来改变。