三氧化二砷联合小白菊内酯诱导人骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

滕松龄，陈兵，李崇杰

（沈阳医学院附属中心医院 手外1科，辽宁 沈阳 110024）

骨肉瘤是高度恶性的间叶组织肿瘤，好发于青少年和年轻成人，骨肉瘤在局部呈侵袭性生长并且易发生转移，现在多采用化疗辅助手术的联合疗法。但因为骨肉瘤细胞对化疗药物缺乏敏感性，以及单一传统化疗药物易产生的耐药性，使得多种抗肿瘤药物联合辅助化疗方案日益受到青睐。三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）已经被证明对于早幼粒细胞白血病及其他肿瘤细胞有诱导凋亡作用[1，2]。小白菊内酯(Parthenolide，PTL)是从草本类植物艾菊内纯化出的一种倍半萜烯内酯化合物，近年来研究发现，小白菊内酯具有较强的抗肿瘤活性，在体外可抑制多种肿瘤细胞株的生长增殖，并诱导其凋亡[3]。此外，小白菊内酯还可以增强肿瘤细胞对其他多种抗肿瘤药物的敏感性[4]。因此，我们将小白菊内酯与三氧化二砷通过单独以及联合作用于骨肉瘤U2OS细胞株，来观察研究其诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人骨肉瘤U2OS细胞株采购自中国上海科学院生化细胞研究所，三氧化二砷（北京双鹭药业股份有限公司），小白菊内酯（索莱宝公司），DMEM培养基，胎牛血清（Thermo公司），MTS试剂盒（美国Promega生物科技公司），倒置相差显微镜（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

U2OS细胞培养于DMEM培养基中（含10%胎牛血清培养液），置于37℃，5%CO2细胞培养箱中，2～3 d传代一次。

1.2.2 药物的给予方法

0.25 %胰酶消化对数生长期细胞，计数后，按5×105/mL，将细胞接种于培养板中，待细胞贴壁后给药。三氧化二砷组：1，2，4 μmol/L 三种浓度；小白菊内酯组：5，10，20 μmol/L三种浓度；以及三氧化二砷2 μmol/L分别联合小白菊内酯5，10 μmol/L组，同时设立空白对照组。

1.2.3 应用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化

取对数生长期的细胞用于实验，单独及联合给予小白菊内酯以及三氧化二砷，于24 h后进行细胞形态学观察。

1.2.4 MTS法检测U2OS细胞增殖抑制率

采用MTS法检测不同浓度三氧化二砷和小白菊内酯单独及联合作用对人骨肉瘤U2OS细胞株的增殖抑制率。给予不同浓度的药物分别作用于U2OS细胞24，48及72h后，加入20μL/孔的MTS试剂，继续培养4h，用酶标仪读取每孔的吸光度值(OD=490nm)。细胞增殖率（%）=实验组OD值／对照组OD值×100%。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 倒置相差显微镜观察U2OS细胞形态学变化

分别给予剂量为 PTL 2 μmol/L，ATO 5 μmol/L以 及 ATO 2 μmol/L+PTL 5 μmol/L 和 ATO 2 μ mol/L+PTL 10 μmol/L，24 h后观察骨肉瘤 U2OS细胞。同空白对照组相比，治疗组细胞均出现变小变圆，有不同程度的萎缩。而与单独用药组相比，联合用药组细胞破坏程度进一步增加，许多细胞脱落后漂浮于培养液中，更多的细胞进入凋亡状态（图1）。

图1 单独及联合应用三氧化二砷、小白菊内酯作用于U2OS细胞的形态学变化

2.2 不同浓度的三氧化二砷和小白菊内酯单独及联合用药对骨肉瘤U2OS细胞增殖的影响

2.2.1 单独应用三氧化二砷对U2OS细胞的影响

三氧化二砷对骨肉瘤U2OS细胞具有增殖抑制作用，随着浓度的增大及时间的增加，抑制作用也逐渐增加（P＜0.05，图 2）。

2.2.2 单独应用小白菊内酯对U2OS细胞的影响

结果表明小白菊内酯可抑制U2OS细胞的增殖，同时同样存在浓度及时间依懒性，不同浓度及时间点相比较差异有显著性（P＜0.05，图3）。

图2 三氧化二砷单独作用于U2OS细胞，分别在24,48,72 h计算出生存率

图3 小白菊内脂单独作用于U2OS细胞，分别在24,48,72 h计算出生存率

2.2.3 联合应用三氧化二砷及小白菊内酯对U2OS细胞的影响

两个联合应用组分别作用于骨肉瘤细胞，MTS法检测其24，48，72 h的生存率，结果表明，联合给药组也同样存在剂量与时间的依赖性，且联合给药组对于骨肉瘤细胞U2OS的增殖抑制作用明显好于单独给药组（P＜0.05，图 4，5）。

图4 ，5 联合应用作用于U2OS细胞，分别在 24，48，72 h 计算出生存率

3 讨论

三氧化二砷可以通过多种信号通路促进肿瘤细胞的凋亡[5，6]，我们的实验结果也再次证明了三氧化二砷对骨肉瘤U2OS细胞存在增殖抑制作用，且具有时间与剂量的依赖性。但我们考虑到三氧化二砷在高浓度下的毒副作用以及单一用药时产生的耐药性等问题，从而想寻找一种可以与其协同作用，增加疗效的药物。小白菊内酯为一种倍半萜稀内酯化合物，其已被证明可通过抑制NF kappa B的激活从而诱导肿瘤细胞的凋亡[7]，同时亦发现其可以作为某些肿瘤的放疗或化疗的增敏剂[8-10]。本研究显示应用三氧化二砷联合小白菊内酯的联合给药组，对骨肉瘤U2OS细胞的增殖抑制作用明显高于单独给药组，同时我们发现，联合给药组（2μmol/L三氧化二砷联合10 μmol/L小白菊内酯）在早期（24 h），即可达到很高的抑制水平，U2OS细胞的增殖抑制率为（71.9±1.64）%。而三氧化二砷及小白菊内酯单独给药组的增殖抑制率仅为（26.01±3.73）%及（27.82±0.74）%。在较低浓度的小白菊内酯及三氧化二砷联合给药组也在48 h后对U2OS细胞的抑制率达到了（72.46±2.13）%，而三氧化二砷与小白菊内酯在同一时期的增殖抑制率为（39.76±1.29）%及（25.61±2.45）%。本实验结果表明，联合应用小白菊内酯及三氧化二砷对于诱导骨肉瘤U2OS细胞的凋亡具有协同作用，并存在时间与剂量的依赖性，同时在较低的给药浓度的条件下，就可达到较理想的协同抑制效果。因此，我们认为把三氧化二砷与小白菊内酯联合应用于骨肉瘤的临床治疗，有着良好的前景。同时，对于三氧化二砷及小白菊内酯对骨肉瘤U2OS细胞的作用机制等问题，还需进一步的研究。