变应原组分诊断及肽段微阵列技术在牛奶过敏特异性诊断中的应用

姜楠楠，向 莉

牛奶及牛奶制品是婴幼儿蛋白质、能量以及钙的主要来源，是非母乳喂养的婴儿最先被引入的蛋白质，包括普通配方奶、低致敏性水解配方奶和氨基酸配方制品。牛奶蛋白是儿童食物过敏最常见的过敏原之一，牛奶过敏(cow’s milk allergy, CMA)的患病率因研究人群和研究方法不同存在差异，西方国家中CMA患病率约0.54%～7.5%[1-3]，近期发表的一项中国人群的前瞻性研究显示经由食物激发试验证实的CMA的患病率为2.69%[4]。CMA免疫学机制包括IgE及非IgE介导，其中IgE介导速发型CMA约占60%[5]。典型的IgE介导牛奶过敏症状为进食牛奶或牛奶制品后1～2 h内出现皮肤(荨麻疹、血管神经性水肿、皮肤瘙痒等)，呼吸道(咳嗽、喘息、喉水肿等)、胃肠道(腹痛、恶心、呕吐、腹泻等)和/或全身多系统的严重过敏反应(血压下降、意识丧失等)。大多数CMA患者可随年龄增长逐渐对牛奶及牛奶制品产生耐受，一项研究显示IgE介导CMA 4岁缓解率为19%，8岁缓解率为64%，16岁缓解率为79%[6]。本文综述相关国内外主要文献，就IgE介导CMA特异性诊断尤其是变应原组分诊断(component resolved diagnosis,CRD)及肽段微阵列技术在CMA特异性诊断中的应用进行总结，旨在为临床工作提供参考。

1 IgE介导的CMA诊断

IgE介导的牛奶过敏的诊断主要根据临床病史、特异性实验室检查(牛奶蛋白皮肤点刺和/或特异性IgE检测)及口服激发试验。牛奶蛋白SPT阳性和特异性IgE存在仅能代表机体处于致敏状态，不能区分致敏和真正临床过敏。当明确牛奶诱因与致敏证据同时存在时，提示牛奶过敏的可能性大。当牛奶诱因不明确且无致敏证据或存在致敏证据，但无明确牛奶诱因时，需要行口服激发试验确定有无真正牛奶过敏[7]。双盲安慰剂对照的口服激发试验(double-blind placebo-controlled oral food challenge, DBPCFC)为诊断牛奶过敏的金标准。

2 牛奶蛋白的变应原组分理化性质

每1升牛奶约含30～35 g蛋白质，在凝乳酶或酸性条件下(pH 4.6)，蛋白质可分为凝集蛋白-酪蛋白(约80%)和乳清蛋白(约20%)，其中含约25种蛋白，但仅有一部分蛋白具有变应原性。除β-乳球蛋白外，其他牛奶蛋白亦存在于母乳中。酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白为主要致敏组分。75% CMA患者对多种牛奶蛋白同时致敏[8-9]。

酪蛋白提供氨基酸、碳水化合物以及无机物钙和磷，可耐受高温，在>90 ℃热水中煮90 min仍保留强IgE结合能力[10]。除了少量α-螺旋区域，酪蛋白少有二级和三级结构。酪蛋白以微胶粒形式存在，这些微胶粒包含一个非晶态胶质钙磷核心，外围酪蛋白壳[11]。酪蛋白是含量最多的牛奶蛋白，是牛奶主要致敏组分之一，其存在4种不同亚型，分别为α-S1酪蛋白(32%)，α-S2酪蛋白 (10%)，β-酪蛋白(28%)和κ-酪蛋白(10%)。CMA患者通常对多种酪蛋白致敏，牛奶与不同哺乳动物奶(如山羊、绵羊等)的酪蛋白氨基酸序列同源性高达90%，因此牛奶与羊奶间存在交叉反应性，但也有研究显示某些患者选择性对羊奶酪蛋白过敏而对牛奶酪蛋白不过敏，可能与牛奶酪蛋白磷酸化减低其变应原性相关[12-13]。α-S1酪蛋白是含量最多的酪蛋白，已在大肠杆菌中重组表达，光谱分析示其主要以β折叠结构存在，在55 ℃以上的水中加热仍可保持原结构，但对肠道消化酶敏感[14]。

乳清蛋白包括β-乳球蛋白(约65%)，α-乳清蛋白(约25%)，牛血清蛋白(8%)和少量免疫球蛋白、乳铁蛋白[11]。与酪蛋白相比，乳清蛋白对热敏感，在>90 ℃的水煮15～20 min 即可破坏IgE结合表位[10]。α-乳清蛋白是牛奶的主要致敏组分之一，存在于所有哺乳动物奶中，其可以强有力的结合钙离子和锌离子，从而具有抗细菌和/或抗肿瘤活性潜能。氨基酸序列分析示牛奶与人和啮齿类动物乳汁中的α-乳清蛋白氨基酸序列同源性为75%[15]。β-乳球蛋白在生理状态下形成二聚体，在pH低于3时分解为单体，β-乳球蛋白目前无明确功能，是唯一不存在于母乳中的蛋白。牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)是一种球形的，水溶性，非糖基化的血清蛋白，主要作为激素、脂肪酸、甲状腺激素的携带蛋白，同时通过控制血浆胶体渗透压稳定细胞外液容量。BSA与人血清白蛋白和其他种族的血清蛋白比如牛肉、猫、狗中的具有高度同源性。BSA是牛肉主要致敏组分，是牛肉和牛奶临床交叉反应的基础[16-18]。免疫球蛋白(immunoglobulins)在牛奶中以IgG形式存在，可能是牛肉与牛奶临床交叉反应的基础[16]。乳铁蛋白是转铁蛋白家族中的多功能蛋白，是球形糖基蛋白，相对分子质量约80 000 ku，存在于牛奶，唾液、眼泪和鼻腔分泌物。乳铁蛋白是转铁蛋白的一种，能够将铁转移至细胞，控制血液和分泌液中游离铁离子浓度。乳铁蛋白是机体免疫系统的组成部分，参与固有免疫，具有抗微生物活性(抗细菌，抗真菌)，是牛奶蛋白中的次要致敏组分[10]。

3 特异性IgE检测诊断CMA

3.1 牛奶蛋白特异性IgE检测诊断CMA(基于混合牛奶变应原组分特异性IgE检测)

牛奶蛋白特异性IgE(specific IgE, sIgE) 的定量检测是目前主要的体外诊断手段，大于0.35 kUA/L即为阳性，检测的灵敏度高但特异性低。牛奶蛋白sIgE水平越高，提示临床相关性越大。Sampson[19]团队率先基于DBPCFC得出了牛奶蛋白sIgE诊断CMA 95%阳性预计值(positive predictive value, PPV)为15 kUA/L(Pharmacia CAP System FEIA)，即当牛奶蛋白sIgE为15 kUA/L时，诊断CMA敏感性可达95%。其他团队也进行了相关研究，Garcia-Ara等[20]对不同年龄段CMA 90% PPV进行了区分，具体为1.5 kUA/L(13～18个月龄)，6 kUA/L(19～24个月龄)，14 kUA/L(25～36个月龄)。van der Gugten等[21]的研究示2.5岁以下的婴幼儿CMA 95% PPV为7.5 kUA/L。Komata等的研究显示CMA 95% PPV 5.8 kUA/L(<1岁)，38.6 kUA/L (13～24个月龄)，57.3 kUA/L(>2岁)。上述研究结果差异主要由于研究对象纳入标准及牛奶激发试验阳性的判定标准不同所致。尽管牛奶蛋白sIgE检测在CMA诊断中具有高敏感性，但对于非IgE 介导的CMA不适用。

3.2 变应原组分诊断CRD可用于CMA诊断及自然进程预测

目前大多数检测制剂基于天然变应原的提取物，其中混合有多种变应原及非变应原组分，缺点是其为非标准化的变应原制剂，可能缺乏重要的变应原组分，或存在非变应原成分(外源性毒性物质、病原微生物等)，进而影响变态反应性疾病的特异性诊断的准确度。随着变应原研究的不断深入，纯化或基因重组的变应原组分逐渐应用于临床进而实现基于变应原组分的精确诊断[22]。变应原的纯化是指从混合多种天然变应原中提取某一种特定变应原组分，根据其理化性质，应用层析技术，如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析技术等提取出目标变应原组分，纯化的变应原组分可能是多种异构体混合物且具有多种生物学活性[23]。比如在牛奶变应原中，酪蛋白不能通过变应原纯化技术获得单一变应原组分，仅能获得4种酪蛋白异构体的混合物。基因重组变应原是利用现代分子生物学技术，构建已明确的变应原组分的cDNA，将其插入载体(质粒或病毒)，导入宿主细胞，在宿主细胞内表达、分离、纯化，从而得到人工合成的高纯度的致敏蛋白组分[24]。与纯化的变应原分子相比，基因重组变应原具有产量高、生产条件恒定、易于质控、标准化，无内毒素等优点，另一个优势是重组变应原组分在大肠杆菌内表达出的产物缺乏糖基，因此减少了糖基sIgE干扰导致与临床不相关结果[25]。目前，牛奶变应原组分α-S1酪蛋白，α-S2酪蛋白，κ-酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳清蛋白已由重组技术表达出来[26]。变应原组分的纯化/基因重组使定量检测某一变应原组分sIgE 成为可能，亦实现了变应原sIgE检测从“混合变应原提取物”到“变应原组分”诊断(component-resolved diagnosis，CRD)的转变。CRD在临床检验中存在两种形式，单一变应原组分免疫检测(singleplex assay)和变应原组分高通量微阵列免疫检测(multiplex assays)。两者均可通过荧光免疫法进行检测。单蛋白检测为每次仅能检测某一种变应原组分，即“一个标本，一种变应原”，检测哪种变应原组分进行检测需基于患者病史进行选择，缺点是检测需要大量患者血清，是耗时、性价比相对较低的检测手段。高通量微阵列芯片检测可同时检测多种变应原组分，最大优势就是能对多种变应原进行同时检测，且仅需要微量血清。目前商品化的蛋白质微阵列可同时检测103种变应原组分(ImmunoCAP ISAC-CRD 103,Phadis,Uppsala, Sweden)。CRD的应用在变态反应性疾病的诊断和治疗方面均有重要意义，CRD可建立不同个体致敏谱，在多重致敏患者中识别与临床症状相关变应原以及交叉反应变应原(如CCD)，某些变应原组分还可预测食物过敏及严重过敏反应的风险[27]。邓珊、尹佳对蒿花粉相关食物过敏的148例患者进行了变应原组分检测，研究结果显示 严重过敏反应患者与Pru p 3，Ara h 9，Cor a 8致敏相关[28]。

多项研究显示应用CRD相较于传统的应用变应原提取物进行sIgE检测可更好的诊断CMA及预测CMA的自然进程[29]。酪蛋白sIgE水平可作为CMA 患儿是否可耐受烘焙牛奶的标志，多项研究示高水平的酪蛋白及牛奶sIgE预示对烘焙牛奶过敏[30-31]。反之，低酪蛋白sIgE水平提示患儿耐受烘焙牛奶制品的可能性更大[31]。此外，酪蛋白sIgE水平与牛奶过敏自然进程相关，一项52例基于食物激发试验诊断的CMA研究结果示随年龄自然缓解的CMA与低水平的牛奶、α-乳清蛋白, β-乳球蛋白, κ-酪蛋白和α-S1酪蛋白sIgE 相关[29,32]。应用牛奶变应原组分微阵列联合嗜碱性粒细胞活化试验可预测CMA临床症状的严重程度以及CMA的自然进程[33]。

3.3 变应原肽段微阵列技术应用于CMA诊断、自然进程预测以及口服免疫治疗安全性和疗效

变应原组分氨基酸序列的确定使得IgE、IgG、IgG4结合肽段的识别成为可能，深入研究变应原组分的结构、特征及表位不仅有利于深入的研究变态反应发生的潜在机制，也有助于开发新的诊断手段。目前牛奶蛋白主要和次要变应原的肽段/表位均可通过合成或重组的方式构建。α-S1酪蛋白的IgE结合肽段散在分布于氨基酸序列中，重组α-S1酪蛋白或肽段亦可结合IgE[34]。α-S2酪蛋白,β-酪蛋白和κ-酪蛋白IgE结合肽段也已鉴定出来[35]。肽段微阵列技术即将多种合成或重组的变应原组分肽段包被在硝化纤维膜上或活化玻璃表面，通过免疫学方法识别变态反应个体IgE、IgG、IgG4肽段结合模式。分子生物学，生物化学和生物技术的进展推动了肽段微阵列芯片的高通量检测技术[27]。高通量的肽段微阵列检测有助于研究早期变态反应以及监测诱导耐受中的免疫变化[36]。肽段微阵列技术是CMA新型诊断方法[37]。目前已有多项研究基于肽段微阵列检测平台揭示不同IgE肽段结合模式(肽段结合多态性)与CMA临床表型和自然进程相关性研究。Cerecedo等[38]纳入了31例CMA患儿(牛奶过敏组 16例，牛奶耐受组15例)，应用肽段微阵列技术，将牛奶变应原肽段包被于环氧基树脂膜上，研究结果示来自于α-s1, β-, κ-caseins，β-乳球蛋白10个氨基酸区域在牛奶过敏组的结合率明显高于牛奶耐受组。另一项研究纳入41例CMA患儿(牛奶过敏组 17例，烘焙牛奶耐受组16例，自然缓解组 8例)，应用肽段微阵列技术进行IgE/IgG4结合肽段进行研究，肽段来源于α-s1酪蛋白, α-s2酪蛋白, κ-酪蛋白, α-乳清蛋白,β-乳球蛋白，结果示与自然缓解组相比，牛奶过敏组显示出更多样性的肽段结合模式，烘焙牛奶耐受组患儿肽段IgE结合模式与自然缓解组相似，但IgG4肽段结合模式与牛奶过敏组相似，肽段结合的多样性以及高亲和力的IgE结合模式与持续性牛奶过敏及临床表现严重程度相关[39]。Savilahti等[40]纳入11例持续性CMA患儿及12例早期缓解的CMA患儿(3岁之前缓解)，应用肽段微阵列技术，肽段来源于五种牛奶主要变应原，研究结果显示IgE肽段结合模式在持续性CMA患儿稳定，而在早期耐受的患儿，IgE结合肽段少，IgG4与肽段亲和力增强而IgE结合肽段能力随时间而减弱。IgE和IgG4对α-S1酪蛋白, α-S2酪蛋白, β-酪蛋白, κ-酪蛋白结合区域可预测CMA临床结局。此外应用肽段微阵列技术还可预测CMA口服免疫治疗(CMA-OIT)安全性及有效性，Martinez-Botas等[41]纳入了25例接受CMA-OIT及7例未接受OIT的患儿，在治疗的6、12及24个月时间节点，利用肽段微阵列技术探讨变应原肽段IgE/IgG4在OIT中的变化及与OIT安全性、有效性的相关性，根据OIT不良反应分为高、中、低风险组，结果显示CMA-OIT可诱导IgG4结合肽段数量快速增加，而IgE结合肽段数量缓慢下降，高风险治疗组在治疗过程中结合IgE酪蛋白肽段数量显著高于低风险和中风险组[41]。 最近发表的一项研究显示，应用高通量的Luminex 肽段微阵列(包含牛奶五种变应原组分的66条肽段)预测CMA-OIT的有效性，结果显示，CMA-OIT不管结局如何(脱敏或持续无反应)，IgE/IgG4 肽段结合模式在治疗过程中均可发生显著改变。与CMA-OIT有效组相比，CMA-OIT持续无反应组对40条肽段抗体结合明显减少，基于肽段结合模式，此研究还构建模型预测CMA-OIT持续无反应性，该模型应用了6条IgE结合肽段，预测准确性可达87%[42]。

4 小结

CMA患者牛奶蛋白的致敏谱因研究对象和年龄呈现不同致敏模式，大多数CMA显示牛奶变应原多重致敏，酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白为主要致敏组分，酪蛋白sIgE水平与持续性牛奶过敏相关，基于变应原组分及变应原肽段微阵列技术对CMA自然进程、临床症状严重程度以及免疫治疗的安全性和有效性有提示作用，但目前仅限于小样本临床研究，尚需严格纳入牛奶过敏的大规模人群进行研究确定临床相关变应原组分及肽段。