FANCJ在HEK293T细胞中的表达、纯化及活性检测

袁濮玉，撖 荣，杜佳慧，储小玲，吴 洁，杨 凡，苏 倩，邱桥成，薛胜利△，刘松柏▲

(1.苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009；2.苏州大学附属第一医院血液科，苏州 215006)

FANCJ(Fanconi anemia complementation group J)基因编码的蛋白是第1个被确认的同乳腺癌相关肿瘤抑制因子BRCA1(breast cancer 1,early onset)相结合的蛋白，因此其最初被命名为BRCA1结合的C端解旋酶(BRCA1-associated C-terminal helicase1， BACH1)；随后又被命名为BRCA1相互影响的蛋白C端解旋酶(BRCA1 interacting protein cterminal helicase 1，BRIP1)以避免同具有类似名称的转录因子相混淆；而近年来该蛋白被发现是范可尼贫血(fanconi anemia，FA)通路的成员之一，故被称为FANCJ蛋白[1-3]。FANCJ是一种ATP依赖的5′-3′DNA解旋酶，最初从FA和早发性乳腺癌患者中鉴定出来一些错义突变位点(A349P,R251C,Q255H，P47A，M299I等)，这暗示FANCJ蛋白可能作为肿瘤抑制因子维持基因组的稳定性[4-5]。随后的研究表明，FANCJ蛋白在DNA链间交联(interstrand cross-link，ICL)修复、复制胁迫响应及G4-DNA结构拆解过程中发挥重要功能[6-8]。FANCJ编码的序列突变与乳腺癌发生紧密相关，在大量的FANCJ-like解旋酶结构域中发现Fe-S簇结构域，已经证实了 FANCJ在motifⅠ、Fe-S和BRCA1互作的结构域发生错义突变，与乳腺癌及FA的发生有关[9-10]。遗传学研究证实，N端Fe-S簇结构域(aa276-aa362)及MLH1结合区(aa128-aa158)与FANCJ解旋酶活性相关，而非BRCA1结合区[2]。体外生化实验发现A349P、R251C、Q255H等错义突变失去了DNA解旋酶活性，而M299I突变体蛋白的ATP水解酶活性及DNA解旋酶活性都比野生型高，从而为阐明疾病发生的机制奠定了基础[11-14]。

在对急性髓系白血病(AML)患者基因图谱的研究过程中发现，FANCJ基因的编码区c.A587G:p.N196S位置在AML患者中出现了复现性错义突变。但这种突变对活性的影响尚不明确。N196S突变位于与ATP结合的区域，可能对活性造成一定影响。因此，本研究构建了FANCJ及N196S突变体表达质粒，并对在HEK293T细胞中表达纯化的蛋白进行了DNA解旋酶活性检测，为进一步研究FANCJ在白血病发生过程中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体购自广州辉骏生物科技有限公司，FANCJwt编码区全长基因特异性引物(FANCJF:5′-TCG AGC TCA AGC TTC GAA TTC ATG TCT TCA ATG TGG TCT G-3′;FANCJR:5′-TTA TCT AGA GTC GCG GGA TCC TTA CTT AAA ACC AGG AAA CAT G-3′),N196S点突变构建特异性引物(FANCJ-N196S/F:5′-GTA AAA CTC AGC TCT CCA CTG-3′;FANCJ-N196S/R:5′-AGT CTT TCC TGA ATC AAC-3′)，以及荧光标记DNA底物均在华大基因科技公司合成；HEK293T细胞购自上海拜力生物科技公司，大肠杆菌感受态DH5α购自北京全式金生物技术公司，Polyjet购自美国SignaGen公司，限制性内切酶ECORⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、DpnⅠ及T4 DNA连接酶均购自美国NEB公司，ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit连接酶购自诺唯赞生物公司，PCR、质粒提取试剂盒购自天根生物公司，Flag单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗、3xFlag肽段购自英国Abcam公司，M2 Beads购自美国Sigma公司，银染试剂盒购自碧云天生物公司。细胞培养基及血清的细胞培养相关试剂均购自四季青公司。

1.2 方法

1.2.1 FANCJwt及N196S突变体真核表达载体的构建 选取HEK293T细胞来源的cDNA片段，采用聚合酶链反应(PCR)扩增出相应的FANCJwt编码区全长片段，琼脂糖电泳鉴定DNA条带并胶回收。ECORⅠ、BamHⅠ双酶切plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体，并纯化回收酶切产物。将酶切后的表达载体及PCR酶切片段利用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit在37 ℃条件下反应30 min，连接产物转化到DH5α感受态中，并涂到带有氨苄抗性的LB平板上，在37 ℃培养箱中过夜，挑选单个菌落进行质粒酶切，测序验证成功的质粒用于后续N196S突变体质粒的构建及接下来的转染。N196S突变体质粒以FANCJwt质粒为模板，利用点突变引物进行PCR扩增，扩增后的产物进行DpnⅠ酶解,然后转化到DH5α感受态中进行与以上相同的后续检测操作。

1.2.2 细胞培养及脂质体转染 HEK293T细胞常规培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，前1 d细胞铺于15 cm培养板中，等细胞密度至70%～80%时，瞬时转染FANCJwt及N196S表达质粒(按照美国SignaGen公司的Polyjet转染说明书进行转染)。

1.2.3 提取总蛋白及蛋白质印迹法(Western blot)检测 转染36～48 h后，弃掉上清液培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3次。刮刀收集细胞并加入适量RIPA裂解液，振荡15 s后置于冰上30 min。12 000×g于4 ℃离心30 min，将裂解液上清液转移到另外一个新的EP管中，利用二辛可宁酸(BCA)方法进行蛋白定量。取50 μg总蛋白经10% SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶分离，100 V情况下利用湿转方法将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂奶粉封闭1 h,磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜3次，每次10 min。加入一抗anti-Flag抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠(1∶2 000)二抗室温孵育1.5 h，PBST洗膜3次，每次10 min。增强化学发光法(ECL)显色和发光(Odyssey Fc成像仪，Gene公司，美国)。

1.2.4 免疫沉淀纯化蛋白与PAGE银染 FANCJwt及突变体N196S表达质粒在HEK293T细胞中转染36～48 h后收集细胞，使用RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃离心获得总蛋白上清液，在上清液中加入20 μL M2 Beads，4 ℃旋转过夜，利用预冷PBS漂洗M2 Beads 3次，然后加入30 μL 3xFlag肽段竞争洗脱Flag-FANCJwt及Flag-N196S蛋白，获得的纯化蛋白用于活性检测及PAGE胶银染(按照碧云天生物公司的快速银染说明书进行银染)。

1.2.5 DNA解旋酶活性检测 DNA解旋酶活性检测采用荧光标记Oligo DNA底物的方法，上下游oligo序列为：DC26(上游)，5′-TAMRA TTT TTT TTT TTT TTT TTT TCC CAG TAA AAC GAC GAC GGC CAG TGC-3′；Tstem25(下游)，5′-GCA CTG GCC GTC GTT TTA CGG TCG TGA CTG GGA AAA CCC TGG CG3-3′。反应前将退火后的DNA底物及反应缓冲液混合在一起，30 ℃情况下水浴反应1 h，然后用加入乙二胺四乙酸(EDTA)及蛋白酶K的6×DNA上样缓冲液进行终止反应。反应产物通过非变性PAGE胶进行分离，分离后的结果通过荧光成像仪进行观察(Odyssey Fc成像仪，Gene公司)。

2 结 果

2.1 通过PCR扩增获得FANCJwt基因cDNA编码区全长 以HEK293T细胞来源的cDNA片段为模板，应用设计的引物进行人源FANCJwt基因PCR扩增，可见3.7×103大小的特异性片段，见图1。

2.2 FANCJwt真核表达载体及N196S突变体构建鉴定 利用FANCJwt表达质粒为模板，通过点突变引物进行PCR扩增，获得的质粒进行测序，鉴定FANCJ基因cDNA 第587位由 A突变为 G，相应氨基酸由N(天冬氨酸)突变为S(丝氨酸)，突变成功。FANCJwt及N196S真核表达载体plvx-EF1-MCS-PGK-PURO，经XbaⅠ酶切后得到约2.5×103(片段)及9.9×103(载体)的两条条带。见图2。

M:DNA分子标记物;N1:阴性对照组1;N2:阴性对照组2;1:PCR产物

图1目的基因PCR扩增

M:DNA标准条带; 1:FANCJwt;2:FANCJ 质粒经XbaⅠ酶切产物; 3:FANCJwt;4:N196S质粒经XbaⅠ酶切产物

图2酶切验证(A)及突变测序验证(B)

2.3 FANCJwt及N196S突变体蛋白在HEK293T细胞中的表达 将构建成功的FANCJwt及N196S突变体表达质粒转染到HEK293T细胞中，Western blot检测到蛋白的成功表达，见图3A。

图3 Western blot检测(A)及蛋白纯化银染成像(B)

2.4 免疫沉淀方法纯化FANCJwt、N196S突变体蛋白及PAGE胶银染 FANCJwt及突变体N196S表达质粒在HEK293T细胞中转染表达后收集细胞，裂解细胞并提前总蛋白，使用M2 Beads沉淀带Flag标签的FANCJwt及突变体N196S蛋白，然后通过3xFlag肽段将蛋白竞争洗脱下来，洗脱下来的蛋白经银染染色，检测到明显的FANCJwt及突变体N196S蛋白条带，见图3B。

2.5 DNA解旋酶活性检测 采用荧光标记Oligo DNA底物的方法(图4A)，对FANCJwt及突变体N196S蛋白进行了DNA解旋酶活性检测，发现与FANCJwt野生型相比，N196S突变体活性明显增强，并疑似具有额外核酸酶活性(产物2)，见图4B。

图4 DNA底物(A)及解旋酶活性检测(B)

3 讨 论

FANCJ在FA、乳腺癌及急性髓系白血病中都存在复现性的错义突变。因此，在不同类型的癌症中，FANCJ都被认为参与了疾病的发生、发展进程，受到了广泛关注。FANCJ具有DNA解旋酶活性，参与包括FA通路在内的多个DNA修复通路，在多种癌症患者中检测到的错义突变体也显示与DNA解旋酶活性的改变相关[5,10]。本课题组前期研究中在急性髓系白血病患者中检测到了一种复现性的N196S错义突变，位于与ATP结合的区域，靠近Fe-S结构域及与MLH1结合的区域，之前少见报道，对FANCJ功能的具体影响目前尚不清楚。因此构建FANCJWT及其突变体的表达载体，纯化蛋白并检测蛋白的解旋酶活性，将为后续FANCJ在白血病发生过程的研究中奠定基础[12]。本研究中，采用HEK293T细胞来源的cDNA片段作为模板扩增出相应的FANCJwt基因序列，将其与plvx-EF1-MCS-PGK-PURO真核表达载体相连，并以此FANCJWT野生型表达质粒为模板，构建了N196S表达载体，转入HEK293T细胞。通过Western blot及银染检测证明成功表达纯化了两种蛋白。后续通过荧光标记DNA底物的方法成功检测到FANCJwt及N196S突变体蛋白解旋酶活性存在差异性，这为后续研究FANCJ突变导致白血病发生的机制奠定基础。总之，本研究结果将为进一步研究FANCJWT及N196S突变体在急性髓系白血病发生、发展过程中的作用机制奠定基础，也为研究FANCJ生物学功能提供了新的思路。