扶正化瘀抗纤方对肝硬化大鼠TGF-β1及PDGF表达的研究

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1.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

肝硬化(hepatic cirrhosis)[1-2]是由一种或多种原因引起的、以肝组织弥漫性纤维化、假小叶和再生结节为组织学特征的进行性慢性肝病，是肝脏疾病发展到中后期的必然结果，早期无明显症状，后期因肝脏变形变硬、导致肝小叶结构和血液循环途径显著改变，破坏和假小叶形成，及血管重建，肝脏逐渐变形、缩小、变硬而发展为肝硬化。肝纤维化[3](hepatic fibrosis，HF)是指由于各种致病因子致肝内结缔组织异常增生，肝内细胞外基质广泛过度沉积的一种病理过程，是所有慢性肝病的病理基础。肝纤维化[4-5]是慢性肝病的重要病理特征，是疾病发展成为肝硬化的一个必经阶段。目前，大量研究报道疾病在肝纤维化阶段是可以逆转的[6-7]。因此，在肝纤维化阶段能否阻断其继续发展，甚至逆转肝脏病理变化，从而防止或延缓肝硬化的发生、阻止肝癌进一步形成，具有十分重要的临床意义。TGF-β1和PDGF是肝脏形成纤维化过程中较为关键的细胞因子。导师廖志峰在临床上治疗早期肝硬化多用扶正化瘀抗纤方进行加减，并取得满意疗效。本次实验拟通过观察扶正化瘀抗纤方对肝硬化大鼠肝脏组织中TGF-β1、PDGF表达的影响，以探索其可能的作用机制，为临床用药提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 动物 SD大鼠40只，SPF级，雄性，体重(200±20) g，由甘肃中医药大学动物实验中心提供，许可证号为SYXK(甘)2011-0001。分笼饲养于甘肃中医药大学动物实验中心，SPF级，适应性饲养7 d，饲以标准的大鼠合成饲料，自由饮用纯净水，环境温度( 22±2)℃，相对湿度40%～60% 。

1.2 药物与试剂 扶正化瘀抗纤方基础方：丹参30 g，虫草1 g，桃仁10 g，生黄芪30 g，水蛭3 g，大黄10 g，由甘肃省中医院中药房提供；按组方称取药材，用蒸馏水煎煮药液 3 024 mL(共6周药量)，真空包装后置冰箱4℃冷藏。熊去氧胆酸片(国药准字：H31021950，规格50 mg/片，上海中西三维制药有限公司)使用时以灭菌钵体研磨至细末，蒸馏水配制浓度54 g/L混悬液 1 480 mL(共6周药量)，使用前充分摇匀。四氯化碳(批号：20120128，天津富宇精细化工有限公司)；橄榄油(批号：GB 23347，山东鲁花集团有限公司)；食用酒精(卫生许可证号：5449419807，北京红星股份有限公司)；I抗TGF beta1 Antibody、PDGFA Antibody(批号：P01137、P04085，甘肃瑞德生物科技有限公司)；II抗Rabbit Anti-Mouse IgG(H+L)HRP(批号：S0001，甘肃瑞德生物科技有限公司)。

1.3 仪器 台式高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)；光学显微镜(日本 Olympus 公司)；电泳槽、电泳仪：北京六一；恒温式冷冻切片机(德国LEICA公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药 大鼠常规适应性喂养1周后，随机将动物分为对照组、模型组、扶正化瘀抗纤方组及熊去氧胆酸组，每组各10只大鼠。其中，对照组喂养正常大鼠饲料及饮水，模型组按照经典复合因素并加以改进制备肝硬化模型[8-9]，不进行任何治疗。造模成功的标志大体上观察可见大鼠毛发凌乱无光泽，食欲较差，精神萎靡活动少，对外界刺激反应变慢，体重较正常组相比较明显下降，尸检部分大鼠可见腹水形成，部分可见肝脏表面小结节形成，镜下观察可见纤维组织增生和假小叶形成；药物剂量以成人用药(60 kg体重)按照实验动物体形系数换算法计算，得扶正化瘀抗纤方剂量及熊去氧胆酸剂量。治疗组在造模成功后即予相应药物干预。除对照组外，其余各组均采用30%酒精为唯一饮料，皮下注射CCl4(首次剂量给予5 mL/kg，以后每隔3 d皮下注射40%CCl4油剂3 mL/kg)，予加入0.5%胆固醇的高脂饲料喂养，连续6周成模。

对照组及模型组用等量生理盐水灌胃，扶正化瘀抗纤方组按成人用药有效剂量换算为18.9 g/kg。熊去氧胆酸组成人用药量为10 mg/kg/d，按成人体重60 kg估算，成人每天用药剂量6 g，按0.018换算系数计算大鼠等效剂量为0.54 g/kg，分别灌胃治疗干预。

2.2 取材 治疗6周后分别处死动物取材，取材前1天下午5点后禁食不禁水。于当日上午8点开始，各组大鼠称重后麻醉(按照3.5 mL/kg体重的标准腹腔注射10% 水合氯醛) ，剖腹后腹主动脉采血，4℃静置3 h ，4 000 r/min离心10 min，分离血清；采血后摘取大鼠肝脏，用滤纸吸取血液，生理盐水冲洗干净，取肝脏右叶同一部位约1 cm×1 cm×0.5 cm大小的肝脏组织放入4%多聚甲醛液中固定，以制作病理切片；再取肝脏右叶1 cm×1 cm×1 cm大小的新鲜肝脏组织放入冻存管内，置-80℃ 超低温冰箱保存，用于 RT-PCR备检。

2.3 肝脏组织病理学检查及评分 取于4% 多聚甲醛中固定24 h后的大鼠肝脏，流水冲洗30 min，然后剪成组织大小约3 mm×2 mm×3 mm，各级酒精梯度脱水，二甲苯三级透明，浸蜡包埋，石蜡切片机切片、粘片及烤片后HE染色，HE 染色步骤参照试剂盒说明书。根据《肝脏病理诊断学》[10]标准，肝纤维化程度可分为4期：0期无病理变化；1期汇管区纤维扩大，限小叶内纤维化；2期汇管区纤维化，纤维间隔形成，肝小叶结构存在；3期纤维间隔伴小叶结构紊乱，无肝硬化；4期为早期肝硬化。

2.4 RT-PCR法测定肝脏组织TGF-β1mRNA、PDGFmRNA的表达引物设计 TGF-β1扩增条件：95℃预变性3 min，95℃50 s变性，退火温度58℃，45 s，72℃，60 s反应，40个循环，最后60℃延伸10 min，扩增长度为391 bp；PDGF扩增条件：94℃预变性5 min，94℃30 s变性，退火温度58℃，30 s，72℃，60 s反应，40个循环，最后60℃延伸5 min，扩增产物长度为284 bp；GAPDH扩增条件：94℃预变性3 min，94℃40 s变性，退火温度59℃，50 s，72℃，90 s反应，30个循环，最后60℃延伸10 min，长度584 bp。

NameSequence(5'-3')SizeGAPDH-F5'-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3'22GAPDH-R5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3'21TGF beta'-F5'-CAACAATTCCTGGCGTTACCT-3' 21TGF beta 1-R5'-AAAGCCCTGTATTCCGTCTCC-3'21PDGF a-F5'-CTGAGGATGCCTTGGAGACAAAC-3'23PDGF a-R 5'-TCTTGCAAACTGCGGGAATG-3'20

3 结果

3.1 大鼠一般状况 在实验各组中，对照组大鼠的一般状态良好，能够正常进食及饮水，毛色光泽，活动、反应灵敏，排尿正常，排便呈麦粒状。余实验各组在造模过程中，饮用30%食用酒精饮料后出现暂时的兴奋，后精神欠佳，进食和活动逐渐减少；模型组大鼠毛色蓬乱缺少光泽，体型消瘦，烦躁易怒，弓背喜卧，精神不振，大便较稀，饮食和进水均劣于其他各组；熊去氧胆酸组和扶正化瘀抗纤方组精神、进食方面较模型组好，上述情况较轻，其中扶正化瘀抗纤方组中的大鼠优于熊去氧胆酸组。

3.2 大鼠肝脏组织病理学观察 对照组大鼠的肝小叶结构清晰，细胞胞质丰富，大小排列均匀，窦状间隙未见扩张，肝板结构清楚，呈条索状，由中央静脉向外放射性分布，汇管区无炎性浸润；模型组肝细胞索排列紊乱，肝小叶结构破坏明显，汇管区增大，肝细胞可见不同程度的坏死以及较为广泛脂肪变性，细胞内可见多发炎性浸润，细胞肿胀，排列拥挤，部分区域可见空泡，并有广泛的纤维增生，部分纤维间隔形成；扶正化瘀抗纤方组部分可见细胞空泡或脂肪变性，可见纤维增生，未见纤维间隔形成；熊去氧胆酸组肝小叶结构基本存在，有部分细胞肿胀变性，病变区域较少，炎性浸润明显少于模型组。如图1所示。

3.3 大鼠肝纤维化程度 各组大鼠肝纤维化程度结果显示：对照组中没有肝纤维化发生，模型组大鼠均有不同程度的肝纤维化及出现早期肝硬化征象；扶正化瘀抗纤方组和熊去氧胆酸组肝纤维化发生程度差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同时期大鼠肝纤维化程度

3.4 RT-PCR检测肝组织中TGF-β1mRNA及PDGF mRNA的表达 RT-PCR结果显示：对照组大鼠肝组织TGF-β1mRNA有少量表达，与各组相比，模型组中TGF-β1mRNA表达量显著增多(P<0.01)，各治疗组与模型组相比表达量明显下调，以扶正化瘀抗纤方组与模型组相比下降最为明显(P<0.01)，熊去氧胆酸组表达优于各模型组(P<0.05)。对照组大鼠肝组织PDGFmRNA有少量表达，模型组的表达含量明显高于扶正化瘀抗纤方组和熊去氧胆酸组(P<0.05)。见表2。

组别TGF-β1mRNAPDGF mRNA对照组0.958±0.0421.011±0.179模型组4.136±0.141*5.124±0.448*扶正化瘀抗纤方组1.518±0.144△◇2.023±0.090△◇熊去氧胆酸组2.148±0.194△#2.094±0.169△#

注：与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05；与中药扶正化瘀抗纤方组比较，#P<0.05；与熊去氧胆酸组比较，◇P<0.05。

4 讨论

复合致病因素利用CCl4慢性中毒，高脂肪、高胆固醇、高醇饮食等因素导致肝脏发生炎症，逐渐形成肝纤维化并最终发展成为肝硬化，与临床上多种慢性肝病最终发展为肝硬化相符合[11]。肝纤维化是多种肝脏疾病的结果，肝纤维化主要是由于肝脏组织中细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成与降解失衡所造成。研究表明，TGF-β1在参与调控活化的细胞因子中，能够明显抑制肝组织正常细胞的增殖，激发肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化以促进ECM的产生，并可调节肝细胞的凋亡，是细胞因子中导致肝纤维化最强有力的[12]。

在HSC激活的早期，PDGF表达的增加是其重要标志，实验研究发现PDGF及其受体在肝纤维化发生发展中的表达明显高于正常的肝组织，并且其活性随肝纤维化的程度加重而升高，呈正相关[13]，因此也是肝纤维化形成过程中关键的细胞因子。目前大多数学者认为肝纤维化的形成机制是由于肝脏组织和细胞受到炎症刺激或发生变性坏死时，肝脏中蛋白多糖、胶原等ECM的合成大于降解，使肝脏纤维组织过度沉积。其中HSC的活化可导致大量ECM的合成，是形成肝纤维化的中心环节[14]。若进一步发展，则可合并肝小叶结构的改变、再生结节及假小叶的形成，最终发展为肝硬化(liver cirrhosis,LC)。因此，如何治疗甚至逆转肝纤维化是治疗肝脏疾病的重要环节，而TGF-β1、PDGF是目前发现的重要致肝纤维化因子，在HSC活化、增殖及形成ECM的过程中发挥着重要的调控作用。

众多研究发现表明，慢性肝病、肝纤维化的中医病理改变中以正虚血瘀、湿热瘀毒为主[15-18]。而扶正化瘀抗纤方为导师廖志峰主任医师临床治疗肝纤维化、肝硬化的经验方，是由生黄芪、桃仁、丹参、水蛭、大黄、虫草组成的基本方，临床运用多以此随证加减。其中桃仁、水蛭破血逐瘀，软坚散结为君药，生黄芪、冬虫夏草补虚损、益精气，丹参活血化瘀，大黄荡涤积滞共为臣药，合方共奏破血逐瘀，补气散结，软坚消积之功效，临床加减运用此方已经取得疗效确切[19]。本实验进一步证实扶正化瘀抗纤方可明显抑制TGF-β1 、PDGF在肝纤维化发展过程中的表达，提示其作用机制可能与抑制致纤细胞因子的表达、减少肝星状细胞的激活，从而减少肝组织中的细胞外基质沉积有关，最终减缓了肝纤维化的发展进程。