补肾解毒方对辐射小鼠外周血白细胞及脾脏NF-κBp65的影响

张云静，　杨云霜，　杨利丹，　张箫月，　杜　磊，　张　蓉（.辽宁医学院　医学系，辽宁锦州00；.第二炮兵总医院　中医与康复医学科，北京00088）

补肾解毒方对辐射小鼠外周血白细胞及脾脏NF-κBp65的影响

张云静1，杨云霜2，杨利丹1，张箫月1，杜磊2，张蓉2
（1.辽宁医学院医学系，辽宁锦州121001；2.第二炮兵总医院中医与康复医学科，北京100088）

目的：初步探讨中药方剂补肾解毒方对辐射小鼠外周血白细胞及脾脏NF-κBp65的影响.方法：将背景为C57BL/10JTLR4＋/＋及TLR－/－小鼠均随机分为空白对照组、辐射模型组、补肾解毒方组，除空白对照组外，其余小组小鼠均接受一次性6Gy60Co γ-射线的全身照射，观察各组小鼠辐射后基本情况；同时在辐射后第1 d、第14 d、第30 d各组取部分存活小鼠眼球采血，应用全自动生化仪检测各组小鼠白细胞数；并取其脾脏利用Western Blot检测蛋白NF-κBp65的含量，观察蛋白含量差异.结果：（1）与空白对照组相比，辐射后1 d小鼠白细胞呈下降趋势；辐射后14 d，TLR4＋/＋补肾解毒方组白细胞数高于其他3组（P＜0.01或P＜0.05）；辐射后30 d，TLR4＋/＋补肾解毒方组白细胞恢复最快但与空白对照组比较仍有显著性差异（P＜0.05）.（2）与TLR4＋/＋空白对照组相比，TLR4＋/＋辐射模型组NF-κBp65蛋白含量增加（P＜0.05），而TLR4＋/＋补肾解毒方组NF-κBp65蛋白含量首先高于TLR4＋/＋空白对照组（P＜0.05），后与TLR4＋/＋空白对照组蛋白含量水平保持基本一致（P＞0.05）.（3）与TLR4－/－空白对照组相比，TLR4－/－辐射模型组和TLR4－/－补肾解毒方组NF-κBp65蛋白含量增加，而TLR4－/－补肾解毒方组NF-κBp65蛋白含量与TLR4－/－辐射模型组无显著性差异（P＞0.05）.结论：补肾解毒方通过TLR4信号通路减轻辐射所致的白细胞损伤，调节NF-κBp65蛋白含量，提高机体免疫力，有较理想的辐射防护作用.

辐射；TLR4；补肾解毒方

当今世界，放射性核素被广泛应用在战争、能源、医疗等方面，如核武器、核能源、辐射治疗肿瘤等，它在保障国家安全、促进国民经济发展、治疗疾病的同时，也给人类的健康和生命带来威胁，核辐射损伤研究需要从个体医学救治向群体防护转变［1］.

中药资源丰富，毒副作用小，在改善机体免疫力、抗辐射方面具有独特优势.依据传统医学理论［2－3］，总结多年的临床经验，在滋阴补肾六味地黄丸基础上辨证加减具有清热解毒功效的中药［4－5］，形成自拟方补肾解毒方.随着分子生物学的发展，人们对核辐射所致人体损伤的作用机理的研究越来越深入，国内外研究显示Toll样受体4（TLR4）信号通路是辐射免疫损伤的重要通路，本实验将从TLR4信号通路研究补肾解毒方修复受损白细胞、减轻炎症反应、提升机体免疫力及抗辐射的作用机理.

1　材料与方法

1.1材料

由康仁堂药业有限公司颗粒剂调制成的补肾解毒方，中药成分为：冬虫夏草3 g，熟地黄10 g，山药10 g，山茱萸12 g，茯苓10 g，牡丹皮10 g，白花蛇舌草10 g，泽泻10 g.由南京生物医药研究院提供SPF 级276只健康雄性小鼠，质量（20±2）g，其中敲除TLR4基因（TLR4－/－）小鼠138只，正常小鼠（TLR4＋/＋）138只，合格证号SCXK（苏）2010－0001.由北京博奥森生物技术有限公司提供细胞核因子p65蛋白（NF-κBp65）抗体、内参抗体β-肌动蛋白（β-actin）抗体及羊抗兔抗体.

1.2方法

（1）实验分组及处理方法利用随机数字表法将实验小鼠随机分为TLR4＋/＋空白对照组、TLR4＋/＋辐射模型组、TLR4＋/＋补肾解毒方组、TLR4－/－空白对照组、TLR4－/－辐射模型组、TLR4－/－补肾解毒方组，其中空白对照组各18只，其余每组各60只.每天08：00，用0.2 mL生理盐水对TLR4＋/＋及TLR－/－空白对照组、辐射模型组小鼠灌胃，用等容积补肾解毒方中药对TLR4＋/＋及TLR－/－补肾解毒方组小鼠灌胃；连续灌胃10 d，除空白对照组外，第11 d进行6Gy60Co γ-射线照射5 min，剂量率1.2 Gy/min，照射后每组按相应条件继续灌胃14 d.小鼠给药剂量是依据人体给药量换算成的小鼠等效剂量，随小鼠体重变化而变化，一般为13.50 g/（kg·d－1）.

（2）取材小鼠分别于辐射后第1、14、30 d取材，眼球采血，应用全自动生化仪进行血常规测定，检测各组小鼠白细胞数.同时分别将辐射后第1、14、30 d小鼠处死取材，取脾脏，用滤纸吸干血液，将组织置于匀浆器中用组织剪尽量将其剪碎，后加入裂解液于匀浆器中匀浆；组织尽量碾碎；裂解30 min后，将裂解液移至离心管中，4℃12000 r/min，离心5 min，取上清至离心管（EP）中行Western Blot检测NF-κBp65蛋白含量.加入等量十二烷基硫酸钠（SDS）后煮沸20min后行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）.依据目的蛋白的大小将其电转移至硝酸纤维素膜上；用混匀的50g/L脱脂奶粉封闭1～2h；后加入用western一抗稀释液稀释至1∶300的NF-κBp65抗体，4℃缓慢轻摇孵育过夜后，用Tris-Hcl缓冲盐溶液（TBST）洗膜3次，每次7min；加入用脱脂奶粉稀释至1∶2000的羊抗兔抗体，室温轻摇1h后，TBST洗膜3次，每次7min；化学发光法底物显色5min，置暗室压片显影.显影后，将纤维素膜用TBST洗膜3次，每次5 min，加入用脱脂奶粉稀释至1∶2 000的β-actin抗体，室温孵育1h后，TBST洗膜3次，每次7min；加入用脱脂奶粉稀释至1∶5 000的羊抗兔抗体，同样方法洗膜，压片显影.

1.3统计学分析

运用Epson scn扫描western blot条带；以扫描空白灰度为参照，利用photoshop记录灰度的平均值，求其差值比较（一般差值越大，蛋白含量越高）.每实验小组分别计算NF-κBp65/β-actin比值，利用Graphpad prism进行作图分析.实验过程中所测数据均重复3次以上，以P＜0.05为差异有统计学意义.

2　结果

2.1辐射后各组小鼠基本状况

TLR4－/－及TLR4＋/＋空白对照组小鼠在实验阶段一般情况好，毛色光亮，体质量、饮食均在正常水平.其余各组小鼠辐射后均出现饮食量下降、狂躁、易惊恐等情况；第2d后开始精神萎靡不振，毛色暗淡无光甚至部分块状脱毛，饮食量明显下降，体质量普遍减轻.自然死亡的小鼠皮肤见出血迹象，解剖可见部分小鼠有腹水、肝脾肿大、肝结节，肝肾表面有成片点状脓肿，胃肠黏膜损伤，肠梗阻，个别小鼠出现甲状腺肿大及生殖器淤血等现象，余脏器肉眼未见明显异常.

2.2辐射后各组小鼠致死情况

TLR4＋/＋组小鼠至辐射前，辐射模型组共57只，补肾解毒方组55只；TLR4－/－组小鼠至辐射前，辐射模型组共58只，补肾解毒方组共58只.在辐射后第2～14 d，TLR4＋/＋辐射模型组小鼠出现死亡，死亡只数共计41只；在辐射后第7～10 d，TLR4＋/＋补肾解毒方组小鼠出现死亡，死亡只数共计15只；在辐射后第5～13 d，TLR4－/－辐射模型组小鼠出现死亡，死亡只数共计39只；在辐射后第4～13 d，TLR4－/－补肾解毒方组小鼠出现死亡，死亡只数共计38只.与其他辐射后小组比较，TLR4＋/＋补肾解毒方组小鼠出现死亡时间晚，死亡数目较少，各组小鼠存活百分比见图1.

图1　各组小鼠存活百分比曲线Fig.1　Survival percentage curve of mice in each group

2.3辐射后小鼠白细胞数动态变化

与空白对照组相比，辐射后1 d，各组小鼠白细胞数均有不同程度的降低（P＜0.01）.TLR4＋/＋补肾解毒方组白细胞数明显高于TLR4＋/＋辐射模型组、TLR4－/－辐射模型组与TLR4－/－补肾解毒方组，TLR4＋/＋补肾解毒方组白细胞数与TLR4＋/＋辐射模型组对比有显著性差异（P＜0.01），而TLR4－/－补肾解毒方组与TLR4－/－辐射模型组对比则无显著性差异（P＞0.05）.辐射后14 d，各组小鼠白细胞数与空白对照组比较仍有统计学意义（P＜0.01），与同组第1d比较，TLR4－/－辐射模型组白细胞数明显下降（P＜0.01），其余各组差异无统计学意义（P＞0.05），TLR4＋/＋补肾解毒方组白细胞数明显高于其他三组（P＜0.01或P＜0.05）；辐射后30 d，各实验组小鼠白细胞均明显回升，但仍未恢复至正常水平，与空白对照组比较有差异（P＜0.01），与同时间点模型组比较，TLR4＋/＋补肾解毒方组白细胞恢复更快，而TLR4－/－补肾解毒方组白细胞则低于TLR4－/－辐射模型组，见表1.

表1　辐射后各组小鼠白细胞数动态变化Table 1　The dynamic changes of white blood cells in mice after radiation　±s

表1　辐射后各组小鼠白细胞数动态变化Table 1　The dynamic changes of white blood cells in mice after radiation　±s

与同时间点空白对照组比较　1）P＜0.05，2）P＜0.01；与同时间点模型组比较　3）P＜0.05，4）P＜0.01；与同组第1 d比较5）P＜0.05，6）P ＜0.01；与同组第14 d比较 7）P＜0.05，8）P＜0.01

组别　辐射后第1 d　辐射后第14 d　辐射后第30 d TLR＋/＋空白对照组10.27±1.21　9.86±1.66　12.11±1.69 TLR＋/＋辐射模型组　0.48±0.132）　0.60±0.132）　4.48±0.372）6）8）TLR＋/＋补肾解毒方组　1.30±0.292）4）　1.32±0.142）4）　5.80±0.652）6）8）TLR－/－空白对照组　8.90±0.65　7.48±0.97　9.19±0.75 TLR－/－辐射模型组　0.44±0.052）　0.25±0.042）6）　4.35±0.472）6）8）TLR－/－补肾解毒方组　0.54±0.082）　0.65±0.112）4）　3.36±0.662）5）7）

2.4Western Blot检测NF-κBp65蛋白含量

图2　TLR4＋/＋组NF-κBp65蛋白含量变化Fig.2　The changes of NF-κBp65 protein content in TLR4＋/＋group

分别将辐射后第1、14、30 d小鼠处死取脾脏，吸净血液，组织匀浆后行Western Blot检测NF-κBp65蛋白含量.TLR4＋/＋组结果显示：辐射后第1 d，补肾解毒方组、辐射模型组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量基本一致，差异无统计学意义（P＞0.05）；辐射后第14 d，辐射模型组、补肾解毒方组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），但补肾解毒方组蛋白含量低于辐射模型组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；辐射后第30 d，辐射模型组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），补肾解毒方组与空白对照组接近，低于辐射模型组（P＜0.05）（见图2）.TLR4－/－组结果显示：辐射后第1 d，补肾解毒方组、辐射模型组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量基本一致，差异无统计学意义（P＞0.05）；辐射后第14 d，辐射模型组和补肾解毒方组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量升高，补肾解毒方组与辐射模型组差异无统计学意义；辐射后第30 d，辐射模型组和补肾解毒方组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），辐射模型组与补肾解毒方组对比，差异无显著性意义（P＞0.05）（见图3）.TLR4＋/＋组与TLR4－/－组相比，辐射后第1 d，NF-κBp65蛋白含量没有明显差异（P＞0.05）；辐射后第14 d，TLR4＋/＋辐射模型组蛋白含量明显高于TLR4－/－辐射模型组（P＜0.05）；辐射后第30 d，TLR4＋/＋辐射模型组仍高于TLR4－/－辐射模型组（P＜0.05），但TLR4＋/＋补肾解毒方组蛋白含量明显下降，已接近与空白对照组水平（P＞0.05），明显低于TLR4－/－补肾解毒方组，具有统计学意义（P＜0.05）.

图3　TLR4－/－组NF-κBp65蛋白含量变化Fig.3　The changes of NF-κBp65 protein content in TLR4－/－group

3　讨论

随着经济发展、社会进步，核能的利用愈来愈广泛，核辐射的危害也随之突显.前苏联切尔诺贝利核电事故、日本福岛核泄漏事故等，使人们深刻认识到核辐射的巨大危害.药物治疗是核辐射损伤防治的重要方法之一，但目前治疗的药物品种较少、适用性有限、作用机理不够清晰.中药具有低毒、防治结合、适用人群广泛等优点，成为国内外药物研究抗辐射损伤的热点［6］.目前，中药对核辐射损伤的防护机制及作用靶点尚不十分明确，限制了中药抗辐射损伤的推广应用.

近年来，TLR4信号通路在电离辐射损伤机制研究中备受关注［7］.Shan YX等［8］发现巨噬细胞表面TLR4和细胞质中的髓样分化因子88（MyD88）表达含量会随着辐射剂量的增加而上升，推测电离辐射因激活TLR4 MyD88依赖途径介导炎症介质释放而致机体损伤.传统医学将电离辐射归类为火邪、热毒［9］，研究证明［4］六味地黄丸可以清热解毒，驱邪外出，减轻辐射后免疫器官的损伤，促进其功能的恢复.本研究在六味地黄丸方剂基础上优化组合，在原方基础上加白花蛇舌草10 g、冬虫夏草3 g，熟地减量至10 g，不仅有效减轻熟地滋腻碍胃造成的辐射后纳食减少，还在滋阴补肾的基础上清热解毒、补益气血、固本正气，以促进机体更好、更快的修复.为进一步明确TLR4信号通路在辐射损伤中的机制及药物防治作用，本研究应用自拟补肾解毒方对基因工程动物模型进行处理，观察实验动物基本状况、外周血白细胞数及NF-κBp65蛋白含量变化.

辐射可造成机体免疫器官及免疫系统损伤，引起免疫机能障碍，甚至是死亡.辐射后小鼠在饮食、体质量、精神状态等方面发生明显改变，与其他组比较，TLR4＋/＋补肾解毒方组小鼠在辐射后出现死亡的时间晚，死亡数目相对较少，初步说明补肾解毒方通过TLR4信号通路保护机体抗辐射损伤.

机体受到辐射照射后，外周血白细胞几乎都经历这样一个过程：初期迅速下降，极期降到最低值，恢复期则逐步恢复［10］.本研究辐射后1 d各组小鼠白细胞开始下降，辐射后14 d开始回升，辐射后30 d大幅回升，基本符合此变化趋势.辐射后1 d，TLR4＋/＋补肾解毒方组白细胞保留最多，表明补肾解毒方能在辐射初期保护残存白细胞的数量，调动造血系统产生更多白细胞来抵抗辐射损害.辐射后14 d，TLR4＋/＋补肾解毒方组白细胞高于其他三组，表明补肾解毒方在该阶段干预作用最强，其发挥效应的通路为TLR4信号通路，且能有效促进辐射后白细胞的增殖，维持造血微环境的稳定.辐射后30 d，各组小鼠白细胞明显回升，TLR4＋/＋补肾解毒方组白细胞高于TLR4＋/＋辐射模型组，TLR4－/－补肾解毒方组白细胞则低于TLR4－/－辐射模型组，再次证明补肾解毒方发挥主要效应的通路为TLR4信号通路，补肾解毒方能有效修复电离辐射引起的白细胞损伤，促进造血微环境趋向正常，辐射防护作用明显.

NF-κB是常见的核内转录因子，正常与IκB蛋白结合以无活性的形式存在于细胞质中.电离辐射后，脂多糖激活TLR4信号通路使IκB蛋白抑制性激酶活化，IκB蛋白泛素化降解后，NF-κB活化进入细胞核内，与炎症因子相关的DNA序列结合诱导基因转录，最终产生炎症因子介导免疫反应［11］，同时这些物质又作为激动剂进一步作用于NF-κB，使其活性增强，放大炎症信号，引起组织进一步损伤［12］.在TLR4＋/＋组中，辐射后第1 d，补肾解毒方组、辐射模型组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量基本一致，这说明辐射后，机体应激在第1 d不足以激活TLR4下游信号通路，补肾解毒方作用也不明显；辐射后第14 d，辐射模型组、补肾解毒方组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量明显升高，但补肾解毒方组蛋白含量低于辐射模型组，这说明在辐射第14 d TLR4/NF-κBp65信号通路已被激活，TLR4＋/＋辐射模型组 NF-κBp65蛋白含量升高，补肾解毒方也发挥作用使TLR4＋/＋补肾解毒方组NF-κBp65蛋白含量有所降低；辐射后第30 d，辐射模型组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量明显升高，但补肾解毒方组与空白对照组相比，蛋白含量基本一致，这说明在辐射第30 d补肾解毒方通过TLR4/NF-κBp65信号通路对免疫系统作用最为明显.在TLR4－/－组中，辐射后第1 d，补肾解毒方组、辐射模型组与空白对照组相比，NF-κBp65蛋白含量基本一致，说明辐射后各因素未激活TLR4－/－相关蛋白水平变化；辐射后第14 d和第30 d，辐射模型组和补肾解毒方组NF-κBp65蛋白含量均升高，明显高于空白对照组，由此可见，TLR4敲除小鼠使用补肾解毒方未发挥干预作用；TLR4－/－组与TLR4＋/＋组相比，在辐射后第14 d和第 30 d， TLR4＋/＋辐射模型组高于TLR4－/－辐射模型组，而辐射后第30 d，TLR4＋/＋补肾解毒方组蛋白含量明显下降已接近空白对照组水平.说明电离辐射后，补肾解毒方主要通过TLR4信号通路下调NF-κBp65蛋白水平发挥防护效应，抑制炎症发生，增强组织修复能力，提高机体免疫力，进而防止自身炎性损伤而发挥免疫抑制作用.

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［责任编辑：陈咏梅］

Effect of BushenJiedu recipe on peripheral blood leukocytes and spleen NF-κBp65 of mice after radiation

ZHANG Yunjing1，YANG Yunshuang2，YANG Lidan1，ZHANG Xiaoyue1，DU Lei2，ZHANG Rong2
（1.Department of Medicine，Liaoning Medical University，Liaoning Jinzhou 121001，China；
2.Department of Traditional Chinese and Rehabilitation Medicine，the Second Artillery General Hospital，Beijing 100088，China）

Aim：To study the protective effects of BushenJiedurecipe，a hybrid of traditional Chinese medicine，on peripheral blood leukocytes and spleen NF-κBp65 of mice which suffered radiation.Meth-ods：All the mice of C57BL/10J，TLR4＋/＋andTLR4－/－were randomly divided into 3 groups：blank control group，radiation model group，Chinese medicine group.Except the blank control group，the remaining four groups were given the total body radiation of60Co γ-ray with 6 Gy doses.Recording the survival situation，took blood from eyeball and dectected the count of leukocytes in peripheral bloodwith automatic biochemical analyzer，then obtained the spleen of living mice after radiation on 1th day、14th day、30th day，detected the protein level of NF-κBp65 with the technique of Western Blot and ob-serving the differences whin them.Results：（1）Compared with blank control group，leukocyte counts after radiation 1 d are decreased，after radiation 14d，leukocyte counts of TLR4＋/＋Bushenjiedu group are higher than that of the other three groups（P＜0.01 or P＜0.05）；after radiation 30 d，leukocyte counts of TLR4＋/＋Bushenjiedu group recovered fastest，but there are still differences with blank con-trol group（P＜0.05）.（2）Compared with the TLR4＋/＋blank control group，the level of protein NF-κBp65 in TLR4＋/＋radiation model group is increased after radiation（P＜0.05）.However，the level of NF-κBp65 in TLR4＋/＋Chinese medicine group is higher than that of TLR4＋/＋blank control group firstly（P＜0.05），then with one accord（P＞0.05）（3）compared with the TLR4－/－blank control group，bothTLR4－/－radiation model group and TLR4－/－Chinese medicine groupon the level of pro-tein are higher，whereas between of them are parallel（P＞0.05）.Conclusion：The recipe of BushenJiedu can obviously alleviate radiation injury on leukocyte counts，regulate NF-κBp65 protein content by the signal pathway of TLR4，which is relate to immunity and its protective effect is more ideal.

radiation；TLR4；BuShenJieDu recipe

R692.5

A

1000－9965（2015）06－0490－06

10.11778/j.jdxb.2015.06.009

2015－08－11

国家自然基金青年科学基金项目（81202637）

张云静（1988－），女，研究方向：康复医学与理疗学

张蓉，副主任医师，Mobile：18910883010，E-mail：zhangrongyisheng＠sina.com