痰热清注射液中熊胆氧化成分的推测

简龙海， 王 柯， 季 申

(上海市食品药品检验所，上海 201203)

痰热清注射液处方由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘五味中药组成，成分复杂，其中与熊胆粉有关的化学成分分析仅见熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的定量测定报道[1-3]。作者于近期测定了痰热清注射液中熊胆粉部分的指纹图谱[3]，结果指纹图谱中除含熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸外，尚含2个响应相对较高的未知物。经进一步研究发现，该2个未知物可能为熊去氧胆酸或鹅去氧胆酸的氧化物。为确证其化学结构，作者对熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸进行了氧化，以液相色谱-离子阱质谱法(LC-MSn)确证氧化产物，以氧化产物作为对照物进行鉴别。为探索痰热清注射液熊胆粉部分的物质基础，作者以现有对照品对其他可能含有的胆汁酸进行了鉴别；采用HPLC法对中间体熊胆粉提取物进行了成分定量测定；并测定了熊胆粉提取物的干燥失重。研究结果可为痰热清注射液及熊胆粉提取物的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1200型高效液相色谱仪-6330型离子阱质谱联用仪(美国Agilent公司)，1100型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.2 试药 熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、牛磺胆酸钠对照品均由中国食品药品检定研究院提供，批号分别为 0755-9003、110806-200303、816-200004、846-9702、1078-0013、724-9305、815-9702。氯铬酸吡啶(PCC)试剂由上海晶纯试剂有限公司提供，批号20628。乙腈、甲醇、甲酸、冰醋酸均为色谱纯，水为Millipore纯化水。痰热清注射液(批号100124)，熊胆粉提取物(批号090704、090705、090706、090707、090801、090803、090804、090806、090807、090902、090903、090905、091001、091004)均由上海凯宝药业有限公司提供。

2 方法

2.1 指纹图谱[3]中2个未知物(分别以Ⅰ、Ⅱ表示)的结构研究色谱条件 Agilent SB C18色谱柱(2.1 mm×15 mm，3.5 μm)；流动相为乙腈-0.05%甲酸(45∶55)；体积流量 0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量1 μL。

2.2 鉴别其他胆汁酸的色谱条件 Waters Atlantis C18色谱柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；流动相由乙腈(A)和0.01%甲酸(B)组成，梯度洗脱(0 ～ 40 min，20% →50%A；40 ～ 80 min，50%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；进样量1 μL。

2.3 质谱条件 电喷雾离子化源(ESI源)；干燥气温度 350 ℃，干燥气体积流量10 L/min；雾化气 35 psi (1psi=6.895 kPa)；源喷射电压 3.5 kV；正、负离子模式；二级电压(MS/MS Frag Ampl)1.0 V；扫描范围m/z50～1 500。

2.4 对照品溶液的制备 分别取熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、牛磺胆酸钠对照品各10 mg，精密称定，分别置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为1 mg/mL的贮备液。分别精密吸取各贮备液1 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为20 μg/mL的溶液。精密吸取20 μg/mL的溶液250 μL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得500 ng/mL的溶液，供LC-MSn测定。

2.5 未知物Ⅰ、Ⅱ对照溶液的制备 经研究，未知物Ⅰ、Ⅱ的相对分子质量为390.3，但无法获得相应对照品。由于熊去氧胆酸(或鹅去氧胆酸)单羟基氧化物的相对分子质量亦为390.3，故推测未知物Ⅰ、Ⅱ为熊去氧胆酸(或鹅去氧胆酸)的氧化物。相应对照品通过PCC氧化反应进行半合成。PCC试剂是一种温和、高效的氧化剂，可将胆汁酸中的仲醇选择性地氧化为酮而不会进一步氧化为羧酸[5-7]。合成后溶液通过LC-MSn进行分离分析。具体合成方法为：精密称取8 mg(约0.02 mol)熊去氧胆酸对照品，精密加入8.8 mg (约 0.04 mol) PCC试剂，加10 mL冰醋酸，振摇使溶解，静置2 h，精密吸取50 μL，置1 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，供LC-MSn测定。精密称取8 mg(约0.02 mol)鹅去氧胆酸对照品，同法操作。

2.6 供试品溶液的制备 取熊胆粉提取物0.15 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇振摇使溶解，用甲醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液A，供LC-MSn分析和HPLC测定。取痰热清注射液，作为供试品溶液B，供LC-MSn分析。

2.7 熊胆粉提取物中熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的测定 按照文献[3]方法进行测定。

2.8 干燥失重测定 按照文献[4]中的烘箱干燥法进行测定。

3 结果

3.1 对照谱库的建立 熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸为立体异构体(见图1)，其两个羟基均可被PCC试剂氧化成酮[5-8]，故熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的氧化产物最多各有3个，其中2个产物相同。熊去氧胆酸的氧化产物为图1中的C、D、E，相对分子质量分别为390.3、390.3及388.3，鹅去氧胆酸的氧化产物为图1中D、E、F，相对分子质量分别为390.3、388.3及390.3。熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸分别与PCC试剂氧化后的液质联用总离子流图见图2，其中峰1为熊去氧胆酸，峰7为鹅去氧胆酸，峰3与峰5的保留时间相同，负离子质荷比均为m/z389.3；峰4与峰6的保留时间相同，负离子质荷比均为m/z387.3。在正离子模式下，峰3与峰5的一级谱～四级谱均相同(其中一级谱见图3)，峰4与峰6的一级谱～三级谱均相同(其中一级谱见图4)。因此，推断峰3与峰5为同一物质，相对分子质量为390.3，结构式为图1中D；峰4与峰6为同一物质，相对分子质量为388.3，结构式为图1中E。根据质谱测定结果，可判断峰2、峰8的相对分子质量均为390.3，结构式分别为图1中C、F。然后创建一个新谱库，将峰1～峰8的各级质谱图一一录入，作为对照图谱。再将牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、牛磺胆酸对照品溶液的液质联用测定结果录入同一谱库，用于实际样品的鉴别。

图1 熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸及其氧化物的结构式

图2 PCC氧化反应后的液质联用总离子流图

图3 峰3(或峰5)的离子阱质谱一级谱

图4 峰4(或峰6)的离子阱质谱一级谱

3.2 痰热清注射液及熊胆粉提取物中2个未知物的鉴别 痰热清注射液和熊胆粉提取物的液质联用总离子流图中均存在2个未知峰(见图5)。该2个未知峰代表的化合物与作者前期研究中的2个未知物相同[3]。将图5中峰2、峰4的测定结果与“3.1”项下的谱库进行匹配分析，结果可推断图5中峰2对应的结构式为图1中D，图5中峰4对应的结构式为图1中F。

图5 熊胆粉提取物(A)及痰热清注射液(B)的液质联用总离子流图

3.3 痰热清注射液中其他胆汁酸的鉴别 经检索谱库，发现痰热清注射液中含牛磺熊去氧胆酸、胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸以及“3.2”项下的2个胆汁酸氧化物(见图6)。

图 6 痰热清注射液中胆汁酸鉴别结果

3.4 熊胆粉提取物中熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸及干燥失重的测定 熊胆粉提取物样品的色谱图见图7，定量测定[3]结果见表1，其中百分比表示测得的熊去氧胆酸(或鹅去氧胆酸、干燥失重)的质量(mg)占称取量(mg)的百分比。

图 7 熊胆粉提取物的HPLC图

4 讨论

4.1 PCC氧化反应的介质一般用二氯甲烷[5-8]，但熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸难溶于二氯甲烷，故须另外选择介质。冰醋酸既可溶解PCC试剂，又可溶解熊去氧胆酸等胆汁酸，故本研究将其作为反应介质。结果表明冰醋酸适用于熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的PCC氧化反应，而且反应终溶液经乙腈稀释后可直接用于反相LC-MSn分析，操作简便、快速。PCC试剂与熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸之间的摩尔数比可影响各产物的产率，该比值约为2∶11时，可同时产生3个氧化物，具体规律有待深入研究。熊胆氧化产物的结构需进一步明确。

表 1 熊胆粉提取物中成分测定及干燥失重结果

4.2 文献[9-15]报道熊胆粉中含牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、去氢胆酸等，主要含牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸。在制备熊胆粉提取物过程中，熊胆粉需经过水解步骤。牛磺熊去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸可分别水解为熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸。故熊胆粉提取物主要含熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸。牛磺熊去氧胆酸和胆酸的含有量均较低，其测定方法将另行研究。

4.3 作者曾建立并验证了痰热清注射液中熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸的定量测定方法[3]。该方法验证结果同样适用于熊胆粉提取物的测定。因熊胆粉提取物可完全溶解于甲醇中，故提取回收率为100%。其余参数，如线性关系、精密度、稳定性、重复性等，均无需另行验证。

4.4 熊胆粉提取物中可能含残留溶剂以及水分，本研究采用烘箱干燥法测定其总量。

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