PD—L1和P63在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义

张长忠 冯瑶 郑绘霞

【摘要】 目的：探讨PD-L1和P63在弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的表达及临床意义。方法：选取2013年1月-2017年10月山西医科大学第一医院收治的DLBCL患者65例为研究组，另外选取同期反应性增生淋巴结组织患者20例为对照组。采用免疫组化Envsion法检测两组PD-L1和P63的表达情况，分析PD-L1、P63的表达与DLBCL临床病理特征之间的关系，并分析DLBCL组织中PD-L1与P63表达的相关性。结果：研究组中PD-L1、P63的阳性表达率均高于对照组（P<0.05），且P63在反应性增生淋巴结组织中均呈阴性；PD-L1、P63的表达均与DLBCL患者年龄、性别、分期、发生部位及LDH水平无相关性（P>0.05）；但PD-L1表达与DLBCL患者IPI评分相关（P<0.05），P63表达与DLBCL患者IPI评分无相关性（P>0.05）；在DLBCL组织中，PD-L1与P63的表达呈正相关（r=0.252，P=0.043）。结论：PD-L1、P63在DLBCL中均有表达，有助于诊断和预后评估。

【关键词】 弥漫大B细胞淋巴瘤； PD-L1； P63； 表达； 临床意义

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of PD-L1 and P63 in diffuse large B cell lymphoma（DLBCL）.Method：A total of 65 DLBCL patients in the First Hospital of Shanxi Medical University from January 2013 to October 2017 were selected as study group，and 20 patients with reactive lymph node hyperplasia were selected as control group.Immunohistochemical Envsion method was used to detect the expression of PD-L1 and P63 in two groups.The relationship between the expression of PD-L1 and P63 and the clinicopathological features of DLBCL was analyzed，and the correlation between the expression of PD-L1 and P63 in the DLBCL tissues was analyzed.Result：The positive rates of PD-L1 and P63 in study group were higher than those of control group（P<0.05），and P63 was negative in reactive hyperplastic lymph nodes.There was no correlation between the expression of PD-L1 and P63 with age，sex，staging，location and LDH level of DLBCL patients（P>0.05），but the expression of PD-L1 was associated with IPI score in DLBCL patients（P<0.05），and there was no correlation between P63 expression and IPI score in DLBCL patients（P>0.05）.In DLBCL tissues，PD-L1 was positively correlated with P63 expression（r=0.252，P=0.043）.Conclusion：Both PD-L1 and P63 are expressed in DLBCL，which is helpful for diagnosis and prognosis evaluation.

【Key words】 Diffuse large B cell lymphoma； PD-L1； P63； Expression； Clinical significance

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.002

彌漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的一类非霍奇金淋巴瘤（NHL），占NHL的30%～40%。DLBCL的临床表现、组织形态学、免疫表型、分子遗传学特征极具异质性[1]。目前，联合化疗可以使大约45%的患者达到持续缓解，但仍有大部分DLBCL患者不能达到缓解，或出现缓解后复发。因此通过多种检查手段早期识别DLBCL预后较差的亚群，对于预后判断和治疗选择具有重要作用。目前临床上有效预测疗效或复发的指标是国际预后指数（international prognostic index，IPI），IPI主要是一些临床指标的结合，不包括肿瘤细胞的分子指标[2]。近年来，随着对DLBCL发病机制的深入研究，有研究认为肿瘤分子指标可能对DLBCL的诊断、治疗及预后有很高价值。程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）又名B7-H1，是B7家族的新成员，是近年来发现的与肿瘤免疫逃逸有关的重要分子之一[3]。PD-L1可以与程序性细胞死亡受体1（programmed cell death 1，PD-1）特异性结合，从而控制免疫反应的强度，产生抑制性反应，T细胞的活化、增殖被抑制，导致T细胞凋亡，不能很好地发挥T细胞的抗肿瘤效应。国外一些研究发现，在胃癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、肾细胞癌、胶质瘤和尿路上皮癌等组织中可以检测到PD-L1蛋白的异常表达，且PD-L1的表达与预后呈负相关[4]。P63属于P53基因家族，众所周知P53是一种肿瘤抑制基因，其基因的失活对肿瘤形成起重要作用。P63在肿瘤发生机制中所起的作用目前还不清楚。目前研究证实P63与组织发育密切相关，并可促进肿瘤的生长[5]。PD-L1、P63在DLBCL中的表达以及表达的相关性国内外研究比较少见。因此本文通过免疫组化法观察DLBCL组织中PD-L1和P63的表达，分析PD-L1、P63表达与DLBCL患者临床病理特征之间的关系，并分析DLBCL中PD-L1与P63表达的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月-2017年10月山西医科大学第一医院收治的DLBCL患者65例为研究组。纳入标准：DLBCL患者术前均未经任何形式的放化疗及靶向治疗；DLBCL患者均获取足够组织，均常规固定、脱水、包埋、切片、HE染色，并进行免疫组化检查，切片由两名主任医师确诊为DLBCL，符合DLBCL的WHO诊断标准[6]。排除标准：没有常规病理确诊的患者（常规病理不符合DLBCL的诊断标准）；临床病理资料不完整的患者；合并其他组织部位的恶性肿瘤或转移性肿瘤的患者。另外选取同期反应性增生淋巴结组织患者20例为对照组。患者均对本研究知情，且本研究已经院伦理委员会审核批准。

1.2 免疫组化 采用免疫组化Envsion法进行免疫组化染色，P63、PD-L1抗体购自福州迈新公司和Dako公司。染色步骤：取选好的组织蜡块置于切片机，一般4 μm厚；将石蜡切片置于烤片机烘烤2～3 h；常规脱蜡；使用柠檬酸盐在高压锅进行抗原修复；用磷酸盐缓冲液冲洗后加一抗，放入37 ℃孵箱2 h；再次磷酸盐缓冲液冲洗后滴加二抗，盖过组织，放入37 ℃孵箱25 min；再次磷酸盐缓冲液冲洗，用移液管滴加DAB显色剂；放入苏木精罐复染约5 min；凉水冲洗-1%盐酸酒精-凉水冲洗-氨水-凉水冲洗；乙醇脱水，二甲苯透明；滴加树脂封片。免疫组化已设置阳性、阴性对照。免疫组化结果判定：PD-L1阳性部位为肿瘤细胞的细胞膜和/或细胞质，阳性阈值为10%[7]；P63阳性部位为细胞核，阳性阈值为30%[8]。

1.3 观察指标 观察两组PD-L1与P63表达情况；分析PD-L1、P63的表达与DLBCL患者临床病理特征的关系；分析PD-L1与P63在DLBCL中表达的相关性。

1.4 统计学处理 使用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验；采用Pearson相关性分析PD-L1和P63在DLBCL组织中表达的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组基线资料比较 研究组男34例，女

31例；发病年龄40～85岁，平均（63.00±11.32）岁；AnnArbor分期：Ⅰ期、Ⅱ期32例，Ⅲ期、Ⅳ期33例；淋巴结内病灶32例，结外病灶33例；乳酸脱氢酶（LDH）正常者32例，升高者33例；淋巴瘤国际预后（IPI）评分：0～2分者32例，IPI评分>2分者33例；生发中心型25例，非生发中心型40例。对照组男11例，女9例；年龄35～70岁，平均年龄（55.00±9.50）岁。两组性别、年龄比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

2.2 两组中PD-L1与P63表达情况比较 研究组中PD-L1、P63的阳性表达率均高于对照组（字2=3.856、8.047，P<0.05），且P63在反应性增生淋巴结组织中均呈阴性。见表1和图1～4。

2.3 PD-L1、P63的表达与DLBCL患者临床病理特征的关系 PD-L1、P63的表达均与DLBCL患者年龄、性别、分期、发生部位及LDH水平无相关性（P>0.05）；但PD-L1表达与DLBCL患者IPI评分相关（P<0.05）；P63表达与DLBCL患者IPI评分无相关性（P>0.05）。见表2。

2.4 PD-L1与P63在DLBCL中表达的相关性分析 在DLBCL组织中，PD-L1与P63的表达呈正相关（r=0.252，P=0.043）。见表3。

3 讨论

有研究证实心肌、骨骼肌、胎盤、肺等组织中可以检测到PD-L1 mRNA，而正常组织中却很少能检测到PD-L1蛋白的表达，可以发现PD-L1蛋白表达受转录后调控。在人体巨噬细胞系如扁桃体副皮质区的组织细胞、肝脏巨噬细胞、肺泡巨噬细胞等可检测到PD-L1蛋白的表达[3]。除了在免疫部位表达，PD-L1也表达于各种非造血细胞如上皮细胞、肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、星形胶质细胞、血管内皮细胞等[4]。PD-L1在淋巴组织和非淋巴组织上的表达，说明PD-L1可以调节这些组织的炎症反应以及自身反应性T细胞或B细胞。近年来，随着PD-1/PD-L1通路抗体以及cART细胞免疫疗法的陆续上市，肿瘤免疫疗法成为一个炙手可热的研发领域。免疫治疗给非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈部癌、霍奇金淋巴瘤、白血病等疾病来了新的治疗希望。PD-L1参与肿瘤免疫逃逸并且利用PD-L1进行肿瘤免疫治疗的相关研究，已经成为国内外学者广泛研究和关注的热点。

T细胞是机体抗肿瘤细胞的重要细胞。激活T细胞需要两个信号分别是抗原肽-MHC分子复合物与T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）相互作用的抗原特异性信号，以及共刺激分子所表达的共刺激信号[9]。两个信号同时作用时，才能激活T细胞，并维持T细胞的正常功能。PD-L1与PD-1的特异性结合可以抑制T细胞功能，机体免疫受到抑制，最终抑制了T细胞的抗肿瘤效应[3]。研究表明PD-L1在多种肿瘤组织中高表达，如胃癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、淋巴瘤、胰腺癌、胶质瘤、尿路上皮癌等。由于PD-L1的高表达抑制了T细胞的功能，PD-L1的表达与肿瘤患者的预后呈负相关[10]。Konishi等[11]发现在非小细胞肺癌手术切除标本中PD-L1表达阳性，并且发现PD-L1阳性区肿瘤浸润性淋巴细胞比PD-L1阴性区显著减少，提示PD-L1在抗肿瘤免疫中的负性调控作用。Andorsky等[4]研究认为，间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）和一些DLBCL组织中表达PD-L1，且局限于非生发中心起源的DLBCL中，肿瘤细胞上PD-L1的表达抑制了杀伤性T细胞的活性。在DLBCL中，可能通过PD-LI的过表达来进行免疫逃避，从而促进淋巴瘤细胞的生长。本研究结果显示，PD-L1在DLBCL组织和反应性增生淋巴组织中均有表达，且研究组中PD-L1阳性表达率高于对照组（P<0.05），与文献[12]报道相符。PD-L1在多种肿瘤中都有过高表达的现象，且与患者的预后呈负相关，PD-L1表达越高，预后越差[13]。本研究结果显示，IPI>2分的DLBCL中PD-L1的表达明显高于IPI≤2分的DLBCL（P<0.05）。众所周知，IPI评分高，提示DLBCL预后差，本研究中PD-L1在IPI积分高的患者表达也高，提示预后也差。

P63基因是肿瘤抑制因子P53基因家族中的一员，结构与P53类似，位于染色体3q27-3q29。P63包含两种亚型：TAp63和△Np63。两者功能有明显的差异：TAp63表达升高会促进细胞的凋亡；△Np63表达升高会抑制细胞的凋亡，具有癌基因功能[14]。P63对细胞稳态和胚胎、表皮发育至关重要。目前有研究发现，P63在淋巴瘤中异常表达，与淋巴瘤的增殖和凋亡有相关性，认为P63在淋巴瘤中可能起癌基因作用[15-21]。P63异常表达和结构异常可以在多种类型的淋巴瘤中发现[20-21]。还有研究发现，P63的表达与恶性淋巴瘤细胞的分化阶段有相关性，P63高表达于特殊类型如T淋巴母细胞淋巴瘤[16]。检测P63对淋巴瘤的诊断、恶性程度的判断、临床疗效及预后的判断起重要作用。此外，Fukushima等[5]发现，P63在34%的DLBCL肿瘤细胞中核表达，并且P63阳性的非生发中心DLBCL预后差。本研究结果显示，P63在DLBCL中阳性率为30.8%，而在反应性增生淋巴结呈阴性表达，比较差异有统计学意义（P<0.05），进一步提示P63在DLBCL中起癌基因作用。

近年来，一些研究表明PD-L1的高表达可能是由许多癌基因或者遗传变异引起的。据报道PTEN的功能丧失可能会上调肿瘤细胞中PD-L1的表达，导致PD-L1的过表达[18]。有趣的是，Georgiou等[19]发现DLBCL中存在PD-L1和P63之间的易位，并且RNA测序数据也表明，PD-L1的高表达是伴随着P63的表达。PI3K/AKT/mTOR信号通路在多种肿瘤细胞中异常激活，与癌症的发生发展密切相关。研究表明，在DLBCL恶性进展过程中，PI3K/Akt信号转导通路可被PD-1/PD-L1直接激活[21]。同样的，P63可以调节mTOR信号，这在DNA损伤的进展中起关键作用[22]。因此，本研究推测PD-L1/P63的表达可能激活一些重要的细胞内信号，导致肿瘤的发生发展。本研究结果显示，在DLBCL组织中，PD-L1与P63的表达呈正相关（P<0.05），相关性不是特别明显，可能与样本量小有关。

综上所述，本研究表明PD-L1和P63在一些DLBCL中高表达；PD-L1和P63与患者预后不良相关，为预后不良的指标；PD-L1与P63在DLBCL组织中显示微弱的相关性，还需要更大的样本量和进一步的研究来研究PD-L1和P63的表达是否有协同作用，以及是否PD-L1和P63的转录融合在DLBCL的进展过程中起着关键的作用。

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