金福菇多糖对衰老大鼠p16基因表达影响

张春军 董凯 董琦 宋洁 曾海 杨国宏

【摘要】 目的：探讨金福菇多糖对衰老大鼠p16基因表达的影响。方法：实验材料选用清洁级SD大鼠25只，将实验动物随机分成5组，每组5只。分别为正常对照组、衰老模型组、高剂量治疗组、中剂量治疗组、低剂量治疗组，采用皮下注射D-半乳糖方法建立衰老大鼠模型，除正常对照组外，分别给予金福菇多糖溶液灌胃治疗，采用逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）检测各组大鼠心脏组织p16 mRNA的表达情况。结果：衰老模型组小鼠p16基因表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05），给予金福菇多糖治疗后p16基因相对表达均明显低于衰老模型组小鼠，其中中剂量组最低，三组比较差无统计学意义（P>0.05）。结论：金福菇多糖可有效降低p16 mRNA的表达，从而起到抗衰老的作用，值得进一步研究。

【关键词】 金福菇多糖； 衰老； p16

【Abstract】 Objective：To explore the effect of Jin Fu Mushroom Polysaccharide on p16s gene expression of aging rats.Method：A total of 25 clean grade SD rats were chosen，the animals were randomly divided into 5 groups，5 rats in each group（the normal control group，aging model group，high-dose treatment group，middle-dose group，small-dose treatment group），using the method of subcutaneous injection of D-galactose aging rat model was established，in addition to the normal control group，another groups were given different doses of Jin Fu Mushroom Polysaccharide treatment，the p16 gene expression of rats was detected by reverse transcription PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）.Result：The p16 gene expression of aging model group was obviously higher than that of the normal control group，the difference was statistically significant（P<0.05），after giving Jin Fu mushroom polysaccharide，the p16s gene expression was lower than those of in aging model group，in which the lowest dose group，but there was no significant difference among three groups（P>0.05）.Conclusion：Jin Fu Mushroom Polysaccharide can effectively reduce the p16 mRNA expression，is likely to be the mechanism of heart in the rat model of aging，is worth of further study.

【Key words】 Jin Fu Mushroom Polysaccharide； Aging； p16

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.005

隨着生物医学的发展，人们对食用菌多糖及其衍生物的活性有了更深入的了解，发现食用菌多糖具有一定的辅助医疗作用，如抗菌、抗病毒、抵抗缺氧环境、抗衰老、抗肿瘤、降血脂等，是保健性食品及抑癌药物的重要原料来源[1-3]，被专业人士所认可。近年来，国内外关于食用菌研究很多，但多局限于食用菌培养条件的优化及其生物学特性[4-5]，

而关于金福菇多糖抗衰老的研究较少。衰老与基因有密切关系，被某些基因所控制，随着年龄的增加，多数原癌基因表达或活性降低，使得机体组织和器官发生渐进性退行性变，直到死亡，这是所有生物的特征[6]。细胞衰老是器官功能乃至整个机体功能衰老的主要表现[7]。p16基因是一种抑癌基因，在细胞衰老过程中起着重要的作用[8]。研究表明p16基因作用诱导细胞老化，抑制细胞无限分裂，从而维持细胞周期稳态[9-10]，金福菇是一种分布于热带和亚热带的食用菌，具有丰富营养价值，且具有多种生物活性，近年来，多个课题组成员对金福菇多糖及生物活性进行研究，金福茹多糖具有很好的抗氧化活性[11-12]。金福菇多糖具有抗氧化活性、抗肿瘤、抗疲劳、调节免疫等作用[13]。本实验探讨金福菇多糖对衰老大鼠p16基因表达的影响，从而能够抑制大鼠衰老的作用，旨在对金福菇多糖抗衰老的生物学活性进行研究，为抗衰老的药物研究提供可靠依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料 选用清洁级SD大鼠25只，周龄8～9周，体重160～180 g，由牡丹江医学院动物实验中心提供，合格证号SCXK（黑）（2017-0001）金福菇多糖采用95%乙醇脱脂、水提取、浓缩、醇沉淀、经除蛋白、透析以及真空干燥等程序提取分离纯化，多糖含量大于95%，D-半乳糖为上海试剂二厂生产，RT-PCR引物为上海生工合成。

1.1.2 仪器 DK-S26型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；紫外-可见光光度计（上海光电研究所）；ELGA超纯水机（Veolia Water System公司）；3K15高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；实时定量PCR仪（美国通用生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备及分组 利用D-半乳糖破坏体内氧化酶活性，形成更多氧化产物引起细胞损伤，导致机体功能衰退的原理[14-15]，进行大鼠衰老模型的制备。在牡丹江医学院动物实验中心领取大鼠25只，首先将所有实验动物随机分成正常对照组、衰老模型组、大剂量治疗组、中剂量治疗组、小剂量治疗组5组。正常对照组每天给予注射等量生理盐水，1次/d，共42 d。给予其他组实验动物颈背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg，1次/d，连续给D-半乳糖42 d，建立亚急性衰老大鼠模型。同时每日以400、200、100 mg/kg金福菇多糖水溶液分别给予大、中、小剂量治疗组进行灌胃，正常对照组和衰老模型组给予等剂量的生理盐水，治疗周期为6周。

1.2.2 采集标本及测定 5组大鼠于43 d后，最后一次给药4 h后，采用颈椎脱臼法处死大鼠，取出大鼠的脑海马区组织50～100 mg，采用液氮冷冻后放入研钵，加入1 mL RNA提取试剂（Trizol）进行充分研磨，然后抽提匀浆移入1.5 mL的Ep管中，常温放置5 min；每管加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置2～3 min；4 ℃离心机12 000 r/min离心5 min；取水相后加入0.5 mL的异丙醇，混匀后室温放置10 min。4 ℃离心机12 000 r/min离心5 min，去除上清液，加入1 mL 75%乙醇，摇匀后，4 ℃离心机7 500 r/min离心5 min，去除上清液，剩余部分倒置于超净工作台下干净滤纸上，自然干燥10 min，加入20 μL DEpC水混匀，置于低温冰箱保存。

1.2.3 检测p16mRNA表达 根据Gen Bank提供的p16和内参β-actin的 mRNA序列，应用Primer 6.0软件设计引物，其序列由Invitrogen公司合成。采用实时定量-逆转录聚合酶链反应进行基因片段扩增并定量，p16基因的上游引物为5-CTCCTTGGCTTCATTCTGG-3，下游引物为5-CTCCCTCCCTCTGCTAACCT-3，扩增片段为342 bp；PCR扩增产物为207 bp；RT-PCR反应条件为：Trizol方法提取RNA，用反转录试剂盒将总RNA逆转录CDNA第一链，反应体积20 μL，37 ℃ 孵育15 min，85 ℃ 5 s终止反应，灭活反转录酶，逆转录产物4 ℃保存。95 ℃，5 s，59 ℃，20 s，72 ℃，20 s，40循环。进行琼脂糖凝胶电泳检测及凝胶成像系统扫描分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

将RNA提取，用A 260/A 280的比值均大于1.8的RNA样品提取后，通过紫外线分光度计鉴别其浓度和纯度，结果提取的总DNA质量和纯度都很好，可用于RT-PCR。通过琼脂糖凝胶电泳，以β-actin为参照，图像分析结果显示：衰老模型组小鼠p16基因表达明显高于正常对照组，见图1。金福菇多糖可有效降低大鼠海马p16基因mRNA表达，给予金福菇多糖治疗后p16基因相对表达明显降低，衰老模型组p16基因[（0.205±0.018）μg/mL]表达明显增加，与正常对照组[（0.167±0.013）μg/mL]相比，衰老模型组大鼠p16基因表达明显增加（P<0.05）；与衰老模型组对比，小、中、大剂量治疗组p16基因表达[（0.176±0.009）、（0.177±0.016）、（0.175±0.009）μg/mL]均明显降低，其中中剂量组最低，但三组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

随着现代医学飞速发展，人们对衰老机制有了深层次的认识，提出了许多学说，如：氧自由基占主导地位学说，其认为造成机体衰老的原因是构成生物的基本单位细胞衰老，随着生物年龄的增长，平衡系统逐渐失衡，使得自由基过量而引起的生物衰老[16-17]。端粒假說，认为染色体的端粒是维持染色体结构完整性和稳定性的，随着连续的细胞分裂，端粒逐步缩短，甚至完全丢失，细胞随之发生老化并丧失分裂能力而死亡，这是老年人染色体端粒长度明显低于年轻人的原因[18]。总体说来衰老是许多病理、生理和心理过程综合作用的必然结果，是个体生长发育最后阶段的生物学心理学过程，细胞衰老时，可有效抑制细胞的有丝分裂，刺激连锁反应产生RB蛋白的磷酸化，从而维持衰老细胞形成不可逆性的生长停滞状态[19]。而衰老受某些基因的控制，其中p16基因是细胞衰老遗传控制程序中的重要环节，当细胞衰老时，p16基因的mRNA转录及蛋白表达水平会明显增高，目前认为：其主要通过p16-cyclinD/CDK-RB途径调控细胞周期，细胞增殖周期的调控与个体发育、分化、生长、衰老及癌变均有密切关系[20]。金福菇多糖对大鼠海马p16基因mRNA表达对治疗细胞衰老具有临床意义，研究表明金福菇多糖可有效减少小鼠皮肤内的羟脯氨酸含量，增加小鼠皮肤、血清、肝脏及心脏的SOD、CAT活性，并降低组织内的MDA含量，由此可见在小鼠体内金福菇多糖具有较好的抗氧化活性，可有效减缓糖代谢紊乱所产生的超氧阴离子的损害，从而在一定程度上延缓小鼠的衰老[21]，与本文研究成果一致。

本实验利用D-半乳糖破坏细胞功能，使机体的抗氧化防御系统衰退。持续给予动物体内注射D-半乳糖，在醛糖还原酶催化下产生半乳糖醇，同时生成超氧阴离子，造成细胞膜脂质受损，造成衰老；从而制备成大鼠衰老模型，通过观察发现，金福菇多糖对D-半乳糖衰老大鼠p16基因mRNA的表达可有效降低p16基因表达，与正常对照组相比，衰老模型组小鼠p16基因表达明显增加（P<0.05），给予金福菇多糖治疗后，p16基因相对表达明显降低，其中中剂量组最低，但是三组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。由此可见，金福菇多糖可降低p16 mRNA的表达，很可能是其改善衰老大鼠心脏的机制，利于从分子水平去探讨金福菇多糖抗衰老的机制，为中药防治衰老提供科学依据。

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