狼毒大戟多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的影响

韩德军 夏宁 郑双 蒋丽艳

【摘要】 目的：探讨狼毒大戟多糖（EFP-AW1）对小鼠脾淋巴细胞增殖及细胞因子白介素2（IL-2）和干扰素γ（IFN-γ）分泌的影响。方法：制备小鼠脾淋巴细胞，加入EFP-AW1，使终质量浓度分别为0、25、50、100、200 mg/L，再加入Con A，培养60 h后，采用MTT法检测不同质量浓度狼毒大戟多糖EFP-AW1对Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响；将5种不同浓度的EFP-AW1分别加入小鼠脾淋巴细胞培养体系，再加入Con A，培养48 h后，收集培养上清，ELISA法检测不同质量浓度EFP-AW1对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的影响。结果：与空白组比较，50、100、200 mg/L的狼毒大戟多糖能够促进Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应（P<0.05），并能够提高脾淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ的水平（P<0.05）。结论：狼毒大戟多糖具有一定的免疫增强作用。

【关键词】 狼毒大戟； 多糖； 脾淋巴细胞； 白介素2； 干扰素γ

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Euphorbia Fischeriana Polysaccharide（EFP-AW1） on proliferation and production of interleukin 2（IL-2），interferon γ（IFN-γ） of splenic lymphocytes in mice.Method：Five concentrations of EFP-AW1（0，25，50，100，200 mg/L） with Con A were added to the culture system of mouse splenic lymphocytes for 60 h，the effect of EFP-AW1 at different concentrations on splenic lymphocyte proliferation were detected by MTT method.Five concentrations of EFP-AW1（0，25，50，100，200 mg/L） with Con A were added to the culture system of mouse splenic lymphocytes for 48 h，IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes were examined by ELISA.Result：Compared with the blank group，EFP-AW1 50，100 and 200 mg/L promoted Con A induced T lymphocyte proliferation（P<0.05），and elevated IL-2 and IFN-γ production from splenic lymphocytes（P<0.05）.Conclusion：EFP-AW1 has immunity-enhancing effect.

【Key words】 Euphorbia fischeriana； Polysaccharide； Lymphocyte proliferation； Interleukin 2； Interferon γ

First-authors address： Qiqihar Medical University，Qiqihar 161000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.007

狼毒大戟（Euphorbia fischeriana）为大戟科狼毒属植物，俗称猫眼草[1]。其味辛、性平、有毒，根入药。民间用于治疗肿瘤、皮肤病、结核病等[2-3]。目前关于狼毒大戟药理作用的文献报道较多，尤其是其具有一定的抗肿瘤作用[4-5]。但是对于狼毒多糖成分的分离鉴定少有报道[6-7]。本课题组从中药狼毒大戟的干燥根中发现并提取了低分子多糖化合物EFP-AW1[8]，通过前期实验已证实其能够抑制肿瘤细胞的转移，而这种抑制作用是通过EFP-AW1增强荷瘤机体的免疫监视功能而发挥的[9]。为进一步研究EFP-AW1对机体免疫功能的影响，本实验选择小鼠脾淋巴细胞增殖实验和细胞因子诱生实验，旨在为EFP-AW1的进一步开发应用提供实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料、試剂与动物 狼毒大戟购买于齐齐哈尔市药材公司，经齐齐哈尔医学院郭丽娜教授鉴定为大戟科植物狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud的干燥根，EFP-AW1为本实验室从中药狼毒大戟中新发现并分离提取的低分子多糖化合物[8]，分子量为10.830 Da，纯度>95%，用PBS配制。健康、清洁级ICR小鼠，购自吉林大学白求恩医学院实验动物中心，雌性，体质量18～22 g，饲养环境温度（24±1）℃，湿度（50±10）%，自由饮水采食。RPMI1640培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）：HyClone公司产品；小鼠脾淋巴细胞分离液、白细胞介素2（interleukin 2，IL-2）和干扰素γ（interferonγ，IFN-γ）ELISA检测试剂盒：北京达科为生物技术有限公司产品；伴刀豆凝集素A（concanavalin A，Con A）：美国Sigma公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）：美国Sigma公司。酶标仪（奥地利TECAN公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾淋巴细胞悬液的制备 颈椎脱臼处死小鼠，置于75%的乙醇中浸泡消毒；在超净工作台中向培养皿中加入4 mL淋巴细胞分离液；从烧杯中取出小鼠捋干酒精，无菌取出小鼠脾脏；取出一张200目尼龙膜在淋巴细胞分离液中浸湿，将脾脏放在尼龙膜上用注射器活塞轻轻研磨脾脏；将悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15 mL无菌离心管中，沿管壁缓慢加入500 μL的RPMI1640培养基覆盖，室温，800 g离心30 min；吸出中间灰白色的淋巴细胞层，再加入10 mL RPMI1640培养基洗涤细胞，250 g离心10 min。倾倒上清液，重悬于含10%FCS的RPMI1640培养基中，细胞计数，备用。

1.2.2 小鼠脾淋巴细胞增殖实验 按1.2.1方法制备的小鼠脾淋巴细胞悬液，按5×105/100 μL/孔加入96孔培养板，将细胞分为五组，空白组用完全培养基常规培养，其余各组分别加入不同质量浓度的狼毒大戟多糖100 μL，使狼毒大戟多糖终质量浓度分别为25、50、100、200 mg/L，各组再加入Con A使其终浓度为5 mg/L，每组设3个复孔。置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培养60 h后，各孔加入5 mg/L的MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，终止培养。离心，弃上清，加入150 μL DMSO，振荡溶解结晶，在570 nm波长处测定吸光度（A570 nm）值。

1.2.3 小鼠脾淋巴细胞IL-2和IFN-γ水平的测定 按1.2.1的方法制备的小鼠脾淋巴细胞悬液，按5×106 mL/孔加入24孔培养板，空白组细胞用完全培养基常规培养，其余各组分别加入不同质量浓度的狼毒大戟多糖，使狼毒大戟多糖终浓度分别为25、50、100、200 mg/L，再加入Con A使其终浓度为5 mg/L，每组设3个复孔。于37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养48 h，离心，收集培养上清，

-20 ℃保存，用于测定IL-2、IFN-γ的含量，检测方法参照IL-2、IFN-γ ELISA试剂盒说明书。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，进行单因素方差（ANOVA）分析和t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EFP-AW1对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 与空白组比较，25 mg/L的EFP-AW1对Con A诱导的T淋巴细胞增殖反应无明显影响。50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能够促进Con A诱导的T淋巴细胞增殖反应（t=2.404、3.207、4.528，P<0.05），见表1。

2.2 EFP-AW1对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响 与空白对照组比较，25 mg/L的EFP-AW1对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2无明显影响。50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能够促进小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2（t=2.325、5.181、4.183，P<0.05），见表1。

2.3 EFP-AW1对小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的影响 与对照组比较，25 mg/L组的EFP-AW1对小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ无明显影响。50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能够促进小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ（t=2.704、4.017、4.336，P<0.05），见表1。

3 讨论

多糖是自然界最重要的三种生物大分子之一，广泛存在于动物、植物以及微生物的组织中，具有抗肿瘤、抗病毒、抗辐射等多种重要的生理功能，尤其对机体免疫功能，发挥着重要的调节作用[10-11]。多糖是中药的一类重要成分，研究证明，中药多糖在提高免疫力方面有着较强的活性[12-13]，对机体先天性免疫和获得性免疫均具有调节作用，已成为目前中药多糖药理研究的热点。脾脏是机体重要的免疫器官之一，是机体进行体液免疫和细胞免疫的重要场所[14]。本研究以脾细胞为研究对象，观察狼毒大戟多糖对小鼠脾淋巴细胞的作用，探讨其对机体免疫功能的影响。

淋巴细胞是机体进行免疫应答的重要细胞，在有丝分裂原的刺激下可以发生增殖。活化的T、B淋巴细胞是机体发挥免疫功能的重要因素，T淋巴细胞参与机体的细胞免疫应答，B淋巴细胞能分泌多种抗体，参与机体的体液免疫应答[15]。Con A是T淋巴细胞的有丝分裂原，LPS是B淋巴细胞的有丝分裂原。淋巴细胞增殖能力的强弱影响机体的免疫状态。Con A诱导的T淋巴细胞的增殖能力常用于检测细胞免疫水平[16-17]。本实验小鼠脾淋巴细胞增殖的MTT结果显示，50、100、200 mg/L的EFP-AW1均能够显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖，与空白组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其作用呈现一定的量效关系，表明EFP-AW1能够增强细胞免疫，从而提高机体免疫功能。

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞活化后合成的具有调节细胞功能的低分子可溶性蛋白质[18-19]。检测细胞因子对阐明机体免疫应答具有重要意义。Th细胞前体在抗原刺激下，分化为中间阶段的Th0，Th0在不同细胞因子作用下，选择性地向Th1或Th2细胞分化。Th1细胞偏向于分泌IL-2、IFN-γ、TNF等细胞因子，可促进细胞介导的免疫应答，Th2细胞偏向于分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子，与体液免疫应答相关[20-21]。实验中笔者选择了IL-2和IFN-γ进行检测。结果显示，50、100、200 mg/L的EFP-AW1均可显著提高细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。由此说明合适剂量的EFP-AW1能够促进机体的Th1型细胞免疫应答。

综上所述，狼毒大戟多糖EFP-AW1对机体细胞免疫功能具有促进作用，对体液免疫功能的影响还有待于进一步研究。

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