枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物对黄曲霉菌生长以及产毒效果的影响

隋 明，朱克永,张崇军,王静霞，唐贤华,周荣清

(1.四川工商职业技术学院，四川都江堰 611830；2.四川大学轻纺与食品学院，四川成都 610000；)

黄曲霉毒素主要由曲霉属真菌中黄曲霉菌和寄生曲霉菌在生长过程中产生的一种次生代谢产物，主要包括黄曲霉毒素B1、B2、G1等10多种，其中以黄曲霉毒素B1毒性最强[1-2]。黄曲霉毒素广泛存在环境中的土壤、植物果实中，主要以发霉及污染的玉米和花生中含量较高，对人和动物具有致畸、致癌、致突变作用[3]。人摄入过量的黄曲霉毒素时,会引起人的急性中毒及致癌，被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物，食品中黄曲霉毒素能给人和动物的健康造成严重的威胁[4-5]。乳酸菌是主要存在于人和动物体内的一种有益菌，可以有效调整胃肠道内菌群动态平衡，抑制腐败菌生长及腐败产物的产生，另外，对黄曲霉毒素B1有一定的吸附与抑制作用[6]。枯草芽胞杆菌是一种常用的发酵食品菌种，该菌自身可以合成多种酶类物质，这些酶类物质不仅可以促进营养物质的吸收，还可以抑制肠道内条件致病菌，被广泛应用于食品生产中[7]。关于乳酸菌抑制黄曲霉菌研究比较多，但是枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物是否可抑制黄曲霉菌未见相关报道。因此，本试验选用了枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物对黄曲霉菌生长及产毒进行研究，为进一步研发黄曲霉菌抑制剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 产毒黄曲霉菌CGMCC3.4408标准菌株、枯草芽胞杆菌菌株、乳酸菌菌株由四川大学轻纺与食品学院实验室保存。

1.1.2 试剂与仪器 MRS培养基、PDA培养基、察氏培养基、产毒培养基均购自北京奥星生物技术公司；AFB1检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；隔水式恒温培养箱由上海恒科学仪器有限公司生产；全波长酶标仪由德国eppendour公司生产；PBST、培养皿、EP管、移液枪、分析天平及分析纯等常规试剂及仪器由本实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 黄曲霉菌培养与孢子计数 将黄曲霉菌CGMCC3.4408标准菌株接种于PDA培养基上，28℃培养4 d～8 d后，挑取单个菌落进行扩大培养。取扩大培养的黄曲霉菌培养基，加入一定量的无菌的PBST，将用黄曲霉菌洗脱后，收集到EP管中，用无菌的PBST 8 000 r/min 5 min洗涤3次后，再用无菌纱布过滤3次除去黄曲霉菌孢子的菌丝，进行计数。用无菌的PBST调整黄曲霉菌孢子浓度为1×108cfu/mL备用。

1.2.2 枯草芽胞杆菌和乳酸菌培养与计数 将枯草芽胞杆菌菌株复苏后接种LB液体培养基，37℃振荡培养12 h后，接种在MRS培养基中增殖3代后，进行计数，用MRS培养基调整菌液浓度为1×108cfu/mL；将乳酸菌菌种接种MRS液体培养基中，37℃培养24 h～48 h，用MRS培养基调整菌液浓度为1×108cfu/mL；将枯草芽胞杆菌、乳酸菌按照1∶1比例制成混合培养物。

1.2.3 黄曲霉菌菌落生长抑制率测定 取枯草芽胞杆菌、乳酸菌及枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物各1 mL，分别涂布PDA培养基上，待中药水提物药液液体完全被吸收后，在PDA培养基中心接种20 μL黄曲霉菌孢子悬液(1×108cfu/mL)，28℃进行培养，分别在黄曲霉菌培养后48、72、96 h测量菌落大小。每种益生菌做10个重复，并10个重复的结果平均值进行统计与计算不同益生菌对霉菌生长的抑制率。对照组在PDA培养基上直接接种20 μL黄曲霉菌孢子悬液(1×108cfu/mL)。黄曲霉菌生长抑制率(%)=(空白对照组菌落直径-试验组菌落直径)/空白对照组菌落直径×100。

1.2.4 黄曲霉菌孢子生长抑制率测定 取5 mL的察氏培养基分别加入等量的枯草芽胞杆菌、乳酸菌、枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物，分别接种500 μL的黄曲霉胞子孢液(1×108cfu/mL)，每种益生菌做10个重复，28℃振荡培养，分别在培养后的6、18、24 h取出每种益生菌培养液各0.1 mL均匀涂布PDA平板，28℃培4 h～8 d后，对照组取5 mL的察氏培养基接种500 μL的黄曲霉胞子孢液(1×108cfu/mL)，对黄曲霉菌孢子进行计数。黄曲霉菌胞子孢生长抑制率计算公式为：抑制率(%)=(空白对照组孢子数-试验组孢子数)/空白对照组孢子数×100。

1.2.5 黄曲霉菌产毒量的测定 无菌条件下，在产毒培养基中均匀涂布2 mL甘油水溶液，待液体完全被吸收，分别接种黄曲霉菌孢子生长抑制率试验中，用枯草芽胞杆菌、乳酸菌、枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物培养6、18、24 h后培养液0.1 mL分别接种于产毒培养基，35℃恒温培养15 d～20 d；空白对照组，将无菌的生理盐水和黄曲霉胞子孢液(1×108cfu/mL)按照1∶1比例配合均匀后，取0.1 mL用同样方法接种于产毒培养基中，35℃恒温培养15 d～20 d。试验结束后提取黄曲霉菌，并按照AFB1检测试剂盒进行测定其产毒量。霉菌产毒量抑制率(%)=(空白对照组产毒量-试验组产毒量)/空白对照组产毒量×100。

1.2.6 数据处理与分析 试验结果以平均值±标准差表示，试验数据采用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析，采用Duncan′s 法进行均值比较，以P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 黄曲霉菌菌落生长抑制率测定结果

由表1可知，3种不同类型的益生菌处理组对黄曲霉菌菌落生长有不同程度的抑制效果，在培养48 h时，枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物处理组对黄曲霉菌菌落生长率均高于枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌处理组，但是差异不显著(P>0.05)；随着培养时间的延长，3种不同类型的益生菌处理组对黄曲霉菌菌落生长抑制效果也有所增加，在培养72 h和96 h时，枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物处理组对霉菌菌落生长率分别与枯草芽胞杆菌和乳酸菌处理组相比较，差异显著(P<0.05)，枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌2个组处理组之间差异不显著(P>0.05)。

表1 不同类型的益生菌对黄曲霉菌菌落生长抑制率测定结果(%)

注：同列数据肩标相同字母或无字母为差异不显著(P>0.05)，不同字母为差异显著(P<0.05)。

Note:There is no significant difference in the same column data with same letters or without letter (P>0.05),and the difference with different letters is significant (P<0.05).

2.2 黄曲霉菌孢子生长抑制率测定结果

由表2可知，3种不同类型的益生菌处理组对黄曲霉菌菌孢子生长有不同程度的抑制效果，在培养6 h、18 h、24 h时，枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物处理组对黄曲霉菌孢子的抑制率均高于枯草芽胞杆菌处理组和乳酸菌处理组，差异显著(P<0.05)，枯草芽胞杆菌处理组与乳酸菌处理组之间差异不显著(P>0.05)。

2.3 黄曲霉菌产毒量的测定结果

由表3可知，3种不同类型的益生菌处理组对黄曲霉菌产毒量有不同程度的抑制效果，在培养6 h时，枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物处理组对黄曲霉菌孢子的抑制率均高于枯草芽胞杆菌处理组和乳酸菌处理组，但是差异不显著(P>0.05)；在培养18 h、24 h时，枯草芽胞杆菌和乳酸菌混合培养物处理组对黄曲霉菌产毒与枯草芽胞杆菌处理组、乳酸菌处理组相比较，差异显著(P<0.05)，枯草芽胞杆菌处理组与乳酸菌处理组之间差异不显著(P>0.05)。

表2 不同类型的益生菌对黄曲霉菌孢子生长抑制率测定结果(%)

注：同列数据肩标相同字母或无字母为差异不显著(P>0.05)，不同字母为差异显著(P<0.05)。

Note:There is no significant difference in the same column data with same letters or without letter (P>0.05),and the difference with different letters is significant (P<0.05).

表3 不同类型的益生菌对黄曲霉菌产毒量抑制率测定结果(%)

注：同列数据肩标相同字母或无字母为差异不显著(P>0.05)，不同字母为差异显著(P<0.05)。

Note:There is no significant difference in the same column data with same letters or without letter (P>0.05),and the difference with different letters is significant (P<0.05).

3 讨论

人的黄曲霉毒素中毒主要来源是食品，由于黄曲霉菌广泛存在环境中或者发霉变质的食品原料中，食品在加工过程中易受到黄曲霉毒素的污染，当人食用了被黄曲霉菌污染的食品，黄曲霉毒素主要积蓄在肝脏，导致肝脏解毒功能下降，还可以在人体内产生毒素，毒素随着血液循造成人全身的中毒状态，严重着可导致死亡[8]。有效控制黄曲霉菌生长和产毒量，才能减少食品中黄曲霉毒素污染。黄曲霉毒素清除方法主要包括物理方法、化学方法和生物去毒法，其中生物去毒法被方法被广泛应用[9-10]。许多研究表明乳酸杆菌等益生菌对黄曲霉素毒素具有一定吸附作用。姚婉等[11]研究表明富硒乳酸菌抑制黄曲霉菌生长以及产毒具有很好抑制效果。EraslanG等[12]研究表明在黄曲霉菌培养过程中添加乳酸菌可以抑制黄曲霉菌生长。

国内关于乳酸菌抑制黄曲霉菌研究比较多，但是枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌抑制黄曲霉菌未见报道。因此，本试验将枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌按照1∶1比例制成混合培养物，进一步验证对混合培养物对黄曲霉菌生长及产毒影响。结果显示，枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌混合培养物对黄曲霉菌菌落生长抑制率、黄曲霉菌孢子生长抑制率及黄曲霉产毒量均高于枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌，差异显著(P<0.05)，因而证实了枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌混合物有效抑黄曲霉菌生长和产毒量。从而证实许多枯草芽胞杆菌可以提高乳酸杆菌对黄曲霉菌落生长、黄曲霉孢子生长和黄曲霉菌产毒量，两者具有协同作用。枯草芽胞可以分泌枯草菌素及短杆菌肽等多种活性化学物质，这些活性化学物质可以抑制外界的病菌、毒素等异物。可能由于枯草芽胞分泌的活性化学物质可以抑制黄曲霉菌的生长，吸附或者分解黄曲霉菌所产生的毒素，从而提高黄曲霉菌菌落和生长抑制率及产毒量抑制率。枯草芽胞杆菌和乳酸杆菌等益生菌对黄曲霉毒素菌作用机理复杂，有待进一步研究。