蓝刺头多糖B对H2O2诱导INS-1细胞凋亡研究

王 岩，杨茜雯，杨 英

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018)

蓝刺头(EchinopslatifoliμsTausch)为菊科蓝刺头属植物，又名蜀州漏芦[1]，为嗜砾质中生长的旱生植物，主要分布于蒙古、西伯利亚等地区[2]；蓝刺头多糖B(Echinopslatifoliμspolysaccharide B，ETPB)为本课题组从植物蓝刺头花絮中提取的一种分子量单一的多糖，前期研究证明其具有降低糖尿病模型大鼠血糖，抑制大鼠胰岛β细胞凋亡、促进胰岛β细胞再生及对细胞氧化损伤保护作用[3-4]。其抗凋亡机制尚不明确，本研究采用体外培养INS-1细胞，探究ETPB对由过氧化氢(H2O2)诱导的INS-1细胞凋亡的影响，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 大鼠胰岛细胞瘤细胞(INS-1)，购于北京协和医学院细胞资源中心。

1.1.2 药品及主要试剂 植物蓝刺头采自呼和浩特市，由内蒙古农业大学兽医学院中兽医教研室鉴定；1640培养基(SH30809.01)；胎牛血清(FBS,gibco,1099-133)；胰酶(gibco,25200-056)；β-琉基乙醇(Sigam)；噻唑蓝 (MTT,Sigma,m2128)；二甲基亚砜(DMSO,DN3039A)；过氧化氢(H2O2，北辰方正试剂厂)；维生素C(VC,Solarbio，A8100)；AO/EB双染试剂盒(Solarbio,CA1140)；Trizol、RT-PCR(TaKaRa)；SYBR Green Master(Rox)(Roche,04913914001)；Bcl-2、Bax、B-actin单克隆抗体(Santa Cruz)，HRP标记IgG二抗(北京康为世纪)；SuperSignal West Femto(thermo,34095)。

1.1.3 主要仪器 荧光倒置显微镜(Olympus,Ⅸ71)；CO2培养箱(Thermo,USA)；全功能酶标仪(Synergy H4 Hybrid,USA)；5430R离心机(Eppendorf,Germany)；IQ5 7500 Fast荧光定量PCR(AB，USA)；化学发光成像系统(GE Image Quant LAS 4000)；超纯水仪(UPH,成都优普)；电泳仪(DYY-12,北京六一仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 INS-1细胞培养 培养条件为RPMI1640中加入100 mL/L胎牛血清(FBS)、100 U/mL双抗、50 μmol/L β-巯基乙醇。培养于37℃、体积分数为5%的CO2环境，3 d～5 d传代1次。

1.2.2 蓝刺头多糖ETPB的提取 根据文献[3]，取蓝刺头干燥花絮，水提醇沉得到粗多糖，酶法除蛋白后使用DEAE-52分级纯化，收集0.1 mol/L NaCl洗脱液，透析冻干得ETPB。

1.2.3 ETPB对受H2O2损伤细胞存活率的影响 取对数生长期细胞，消化、计数后调整细胞密度至1×105个/mL接种至96孔板，200 μL/孔，24 h后将细胞培养基弃去，PBS清洗1次，将细胞分为①阴性对照组、②阳性对照组、③ETPB组。①、②组给予完全培养基200 μL；③组加入(含ETPB 7.8、15.6、31.2、62.5 μg/mL完全培养基) 200 μL，作用24 h、48 h(平行试验)后吸出上清，①组加入完全培养基200 μL，②、③加入终浓度50 μm/L的H2O2完全培养基200 μL，作用24 h，弃上清，PBS清洗1次后每孔加入120 μL完全培养基(含20 μL，5 mg/mL，MTT)，37℃孵育4 h，弃上清，加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪检测OD570值，计算细胞存活率。每组设置6个复孔[5]。

细胞存活率=(测试组OD570-本底OD570)/(空白组OD570-本底OD570)×100%

1.2.4 ETPB对H2O2损伤细胞形态的影响 取对数生长期的细胞，消化后计数调整细胞密度至2×105个/mL接种于24孔板，24 h后加药物处理方法同1.2.3，增加④维生素C组(VC，20 μg/mL)；作用48 h后吸出上清，①加入完全培养基500 μL，②、③、④加入含终浓度50 μm/L，H2O2完全培养基500 μL，作用24 h，弃上清，PBS清洗后，每孔加入含20 g/L AO/EB PBS混合液200 μL，37℃孵育5 min后置于荧光显微镜下观察拍照。

1.2.5 RT-qPCR检测INS-1细胞中Bcl-2和Bax基因mRNA表达 细胞接种于6孔板，同1.2.4处理细胞加药，后按照Trizol方法[5]提取总RNA，检测浓度、纯度、完整性后进行反转录。以cDNA为模板，按照20 μL体系加入模板、SYRB mix，上、下游引物(表1)，进行实时荧光定量PCR，反应条件为:95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，40循环，每组4个平行。待测基因相对表达量用2-△△Ct表示，△Ct=Ct待测基因-Ct内参基因，△△Ct=△Ct处理组-△Ct对照组。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot检测INS-1细胞中Bcl-2和Bax基因蛋白表达 细胞处理同1.2.4，提取蛋白后使用BCA法检测蛋白浓度，使用蛋白上样缓冲液稀释至同一浓度，按Western blot方法[5]操作，后使用化学发光成像系统采集发光信号，用Image J软件进行积分光密度分析。

2 结果

2.1 ETPB对受H2O2损伤细胞存活率的影响

药物处理24 h、48 h，与阴性对照组相比阳性对照组存活率显著降低(P<0.05)，降低至79.97%±6.74%、61.67%±3.35%，表明H2O2可损伤细胞，损伤作用随被处理细胞培养时间增加而增强。与阳性对照组相比ETPB各剂量组均能显著提高细胞存活率(P<0.05)，预处理24 h提高至 92.16%±8.33%，预处理48 h提高至79.19%±8.02%。表明ETPB预处理能显著提高受H2O2损伤细胞存活率，效果呈剂量依赖性，ETPB 62.5 μg/mL效果最佳；预处理48 h阳性对照组与各组差值较大，选为后续试验条件(表2)。

表2 INS-1细胞存活率测定结果

注：同列字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

Note:The column date followed with different letters are significantly different (P<0.05),and with same letter are not significantly different(P>0.05).

2.2 ETPB对H2O2损伤的细胞形态学观察

荧光显微镜下观察，阴性对照组荧光颜色大多为绿色且细胞形态呈不规则形状；阳性对照组细胞核出现大量黄色、橘红色荧光，细胞皱缩形态各异，可观察到正常、破碎形态细胞，提示细胞出现大量凋亡、坏死。ETPB各组预处理48 h，发现黄色、橘红色荧光少于阳性对照组，31.2、62.5 μg/mL数量减少明显。VC组效果与ETPB 31.2 μg/mL相近，提示ETPB具有保护氧化损伤作用(图1)。

A:阴性对照组；B:阳性对照组；C:VC(20 μg/mL)；D～G:7.8、15.6、31.2、62.5 μg/mL ETPB；细箭头所指为正常细胞；较粗箭头所指为凋亡细胞；粗箭头所指为坏死细胞

A:Negative control group; B:Positive control group; C:VC 20 μg/ml treated; D-G:7.8,15.6,31.2,62.4 μg/mL ETPB treated.Fine arrows point to as normal cells; Coarser arrows point to as apoptotic cells; coarse arrows point to necrotic cells

图1 ETPB、VC处理48 h对受H2O2损伤INS-1细胞形态的影响(×200)

Fig.1 Morphology changes of INS-1 cells damaged by H2O2after treatment with ETPB and VC (×200)

2.3 ETPB对INS-1细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的影响

Bcl-2结果显示，与阴性对照组1.065±0.171相比，阳性对照组Bcl-2表达量显著下降(P<0.05)，为0.720±0.130；与阳性对照组相比，ETPB预处理各组均可显著提高Bcl-1表达量(P<0.05)并呈剂量依赖，62.5 μg/mL组表达量达到1.448±0.369，显著高于阴性对照组(P<0.05)；阳性药物VC组表达量为1.330±0.209，与EPTB 15.6 μg/mL相近(表3)。

Bax结果显示，与阴性对照组1.080±0.470相比，阳性对照组Bax表达量显著升高(P<0.05)，达到6.345±0.982；与阳性对照组相比，ETPB预处理各组均可显著降低Bax表达量(P<0.05)并呈剂量依赖，最低为62.5 μg/mL组1.542±0.386，与阳性药物VC组1.705±0.201相比差异不显著(P>0.05)(表3)。

2.4 ETPB对INS-1细胞 Bcl-2、Bax 蛋白含量影响

Bcl-2结果见图2，与阴性对照组相比，阳性对照组Bcl-2表达量显著降低(P<0.05)；与阳性对照组相比，ETPB各浓度及VC组Bcl-2表达量均显著升高(P<0.05)； 7.8 μg/mL、15.6 μg/mL、31.2 μg/mL表达量与VC组差异相比不显著(P>0.05)，62.5 μg/mL表达量显著高于阴性对照组(P<0.05)。

表3 各组Bcl-2、Bax mRNA相对表达

注：同列字母不同表示差异显著(P<0.05)、字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

Note:The column date followed with different letters are significantly different (P<0.05),and with same letter are not significantly different(P>0.05).

Bax结果见图3，与阴性对照组相比，阳性对照组Bax表达量显著升高(P<0.05)；与阳性对照组相比，ETPB各浓度及VC组Bax表达量均降低，其中7.8 μg/mL、15.6 μg/mL组差异不显著(P>0.05)，31.2 μg/mL、62.5 μg/mL、VC组差异显著(P<0.05)；7.8、15.2、31.2 μg/mL组表达量高于显著VC组(P<0.05)，62.5 μg/mL与VC组差异相比不显著(P>0.05)。

N.阴性对照组；P.阳性对照组；VC.20 μg/mL

N.Negative control group; P.Positive control group; VC.20 μg/mL

图2 ETPB对氧化损伤细胞Bcl-2蛋白表达影响

Fig.2 Effect of ETPB on Bcl-2 protein expressions in
oxidative damaged INS-1 cells

N.阴性对照组；P.阳性对照组；VC.20 μg/mL

N.Negative control group; P.Positive control group; VC.20 μg/mL

图3 ETPB对氧化损伤细胞Bax蛋白表达影响

Fig.3 Effect of ETPB on Bax protein expressions in
oxidative damaged INS-1 cells

3 讨论

研究表明，氧化应激是引起Ⅱ型糖尿病的重要原因[6]，胰岛β细胞数量减少是Ⅱ型糖尿病发生的重要机制[7-8]，而数量减少主要原因则为凋亡[8]。因此，对氧化应激造成胰岛β细胞凋亡及其机制的探究对糖尿病的防控有重要意义。细胞凋亡在细胞发育及疾病发生中均起着重要作用[9]，凋亡过程中不仅发生细胞个体的变化，还具有特征性形态和亚结构变化[10]。本试验采用使用较为广泛的H2O2模拟氧化应激，50 μm/L作用INS-1细胞24 h，MTT结果显示与阴性对照相比细胞存活率显著降低(P<0.05)，与韩飞等[11-12]研究相符；使用可以在荧光显微镜下区分活细胞、凋亡细胞、坏死细胞的AO/EB染色法观察发现细胞凋亡明显增多，表明氧化应激模型建立成功[10]。ETPB干预24 h、48 h后使用MTT法检测细胞活性，结果显示ETPB各组与阳性对照组相比均可显著提高细胞存活率(P<0.05)；作用48 h进行AO/EB染色观察，结果显示ETPB各组凋亡、坏死细胞明显少于阳性对照组，细胞形态与VC组相近，与低剂量VC具有抗氧化应激作用研究[13]相符。证实ETPB可保护由H2O2造成的细胞存活率降低并抑制细胞凋亡。在已知具有调节凋亡功能的蛋白中，Bcl-2家族(2型淋巴细胞样蛋白) 在各类信号刺激引起凋亡的过程中具有重要作用[14]。Bcl-2能抑制细胞凋亡，Bax可促进细胞凋亡。Bcl-2较高表达时可形成Bcl-2/Bax，其为具有有抑制细胞凋亡功能的异二聚体；Bax较高表达时可形成Bax/Bax，其为具有引起细胞凋亡功能的同二聚体[15]。两者表达量的相对比值是判断细胞是否发生凋亡的重要参照[8]。本研究中，RT-qPCR及Western blot检测结果显示H2O2阳性对照组的Bcl-2表达量在mRNA及蛋白水平表达量均降低，与阴性对照组相比差异显著(P<0.05)；Bax表达量升高，与阴性对照组相比差异显著(P<0.05)；引起Bcl-2/Bax比值降低。EPTB干预组与阳性对照组相比Bcl-2表达量显著升高(P<0.05)；Bax表达量显著降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值升高。ETPB效果呈现一定剂量依赖性，最高浓度62.5 μg/mL效果最佳。

综上所述，ETPB具有抗H2O2引起INS-1细胞凋亡作用，其作用机理可能是通过促进Bcl-2表达，抑制Bax表达。