山羊肺炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

黄 忍，张焕容，毛从剑，彭纯良，孙正楠

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041)

呼吸道疾病是影响山羊养殖业的主要疾病综合征之一，临床症状通常为流涕、喷嚏、干咳、发热、食欲不振等，其中山羊肺炎的发生常导致很高的病死率。多种病原菌均能引起山羊发生肺炎，如支原体(Mycoplasma)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)、溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica，Mh)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)以及链球菌(Streptococcus)[1-4]等。多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌均属于巴氏杆菌科，为革兰阴性杆菌，是存在于牛、绵羊、山羊等反刍动物以及其他多种动物上呼吸道的常在病原菌和机会致病菌[5]，当体内外因素作用使机体免疫力下降时，该病原菌就会侵入机体，表现出较强的致病性和较高的致死率。多杀性巴氏杆菌主要引起禽、猪、兔、牛、绵羊、山羊、野生动物感染发病，主要引起禽霍乱、牛出血性败血症、猪肺疫和猪萎缩性鼻炎等[6-7]。人类也会因被猫或者犬咬伤后感染多杀性巴氏杆菌导致蜂窝织炎和淋巴管炎[8-9]。溶血性曼氏杆菌主要存在于牛、羊鼻咽部等，该菌致病力较强，其产生的白细胞毒素(LKT)能特异性溶解反刍动物的白细胞与血小板[10]，引起牛、羊等反刍动物肺炎、新生羔羊急性败血症[11]。两种病原菌单独存在时均有很强的致病力，均能致山羊发病。Waston P J等[12]报道了多杀性巴氏杆菌引起羔羊的肺炎、败血症；李雪霞等[13]从云南某羊场病羊肺脏中分离鉴定出溶血性曼氏杆菌，并确诊为曼氏杆菌病。在临床上，两者可以继发感染或混合感染。冯旭飞等[14]报道多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌混合感染山羊。目前，多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌在全球范围内均有分布，给养羊业造成了重大的经济损失。2017年10月，四川省乐至县某羊场突发羔羊急性死亡，剖检见肺脏表面有出血点，切面外翻，肺间质明显增宽，刺破有浓汁流出，为典型的肺炎病理变化。为弄清导致该山羊肺炎病例的病原菌，本研究无菌采取肺脏病料分离鉴定病原菌并研究其对Balb/c小鼠的致病性，通过药物试验筛选敏感药物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2017年10月四川乐至县某羊场急性死亡羔羊肺脏样品1份，干冰运送至实验室。

1.1.2 主要试剂和实验动物 绵羊血平板，购自郑州安徒生物工程股份有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)及麦康凯琼脂培养基，均购自杭州微生物试剂有限公司；复方新诺明、头孢噻肟、头孢唑林、头孢拉定、头孢美唑、庆大霉素、链霉素、丁胺卡那、林可霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、亚胺培南、罗红霉素、阿莫西林、青霉素、万古霉素、四环素、多西环素共19种药敏片，均购自杭州微生物试剂有限公司；PremixTaq、DNA Marker Ι，均购自TaKaRa公司；电泳琼脂糖，购自OXOID公司；18 g～22 g Balb/c小鼠购自成都达硕实验动物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离及纯培养 采用无菌技术将烧红的手术刀片对病变肺脏表面灭菌并刺破一小口，接种环无菌取肺组织样本分别划线接种于含100 mL/L马血清的TSA平板和麦康凯平板，37℃恒温培养24 h～48 h，观察平板上生长的菌落，并革兰染色镜检,后挑取单个菌落划线接种于含100 mL/L马血清的TSA平板纯化培养鉴定，将纯化的菌落接种于含100 mL/L马血清的TSB，于37℃、150 r/min空气浴摇床中培养18 h用于后续试验研究，并同时保存菌种。

1.2.2 分离菌的PCR鉴定 微波炉加热法提取分离菌DNA[15]。采用参考文献[14]所设计的特异性引物对相关病原菌进行PCR鉴定,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。PCR反应体系10 μL，其中DNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，PremixTaq5 μL，加无菌水补足至10 μL。PCR反应条件：95℃ 5 min；94℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 45 s；共35个循环；72℃延伸10 min，16℃终止反应。PCR产物用15 g/L琼脂糖凝胶电泳观察。

表1 引物信息

1.2.3 分离菌的溶血试验及对Balb/c小鼠的致病性试验 将分离鉴定的细菌划线接种于绵羊血琼脂平板，观察有无溶血现象。将分离鉴定的多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌分别接种于含100 mL/L马血清的TSB增菌培养。用无菌生理盐水将待检菌液配制成3×108cfu/mL的菌悬液，以0.3 mL每只的剂量分别皮下注射Balb/c小鼠，每种菌注射3只小鼠，对照组3只小鼠注射相同剂量的无菌生理盐水，注射后观察小鼠的发病及死亡情况，并对死亡小鼠进行剖检，观察小鼠组织器官病理变化，并回收培养及鉴定细菌。

1.2.4 分离菌药敏性试验 将分离菌接种于含100 mL/L马血清的TSB培养基，37℃、150 r/min空气浴摇床培养18 h，调菌液至5×105cfu/mL。取200 μL菌液于含100 mL/L马血清的TSA平板，用灭菌棉签均匀涂布于整个平板，将不同药敏片间隔一定距离均匀分布贴于培养基表面，平板置37℃恒温箱培养8 h～12 h，测量抑菌圈大小。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果

从肺脏样品中分离出2种细菌，分别命名为K1和K2。K1革兰染色镜检呈两端着色较深的阴性球杆菌，散在(图1左)，该菌在100 mL/L马血清的TSA平板上为边缘整齐、表面光滑湿润的露珠状小菌落，在麦康凯平板上不生长。K2革兰染色镜检呈两端钝圆，单个、散在排列的阴性短杆状(图1右)，100 mL/L马血清的TSA平板上为圆形、湿润、半透明的中等大小菌落；在麦康凯平板上生长良好，形成中间点状红色隆起、边缘粉红的小菌落。

图1 分离的两种革兰氏阴性杆菌

2.2 分离菌PCR鉴定结果

采用多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌特异性PCR分别对可疑菌进行鉴定，结果显示，2种分离菌PCR产物分别对应约500 bp和200 bp大小的片段(图3)，与预期目的片段相符。结果表明，分离出的2种细菌分别为多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。

2.3 分离菌溶血试验结果

接种溶血性曼氏杆菌的血琼脂平板呈明显的β溶血。多杀性巴氏杆菌在血琼脂平板上生长良好，但未见溶血现象。

M.DNA标准；N.无模板对照；K1.多杀性巴氏杆菌扩增产物；K2.溶血性曼氏杆菌扩增产物

M.DNA Marker；N.Negative control； K1. PCR products ofPasteurellamultocida；K2.PCR products ofMannheimiahaemolytica

图2 2种分离菌PCR扩增产物

Fig.2 PCR amplification products of the 2 isolated bacteria

2.4 分离菌对Balb/c小鼠的致病性

2组试验动物在接种病原菌9 h后均表现出精神沉郁、身体蜷缩、呼吸加快、停止采食的症状。接种溶血性曼氏杆菌的试验小鼠濒死时四肢拉伸，15 h后死亡；接种多杀性巴氏杆菌的试验小鼠24 h后死亡,对照小鼠无不良反应。剖检试验小鼠见暗红色肺脏，并从试验小鼠肺脏分别回收到相应细菌。

2.5 分离菌药敏试验结果

2种病原菌对头孢噻肟、头孢唑啉、头孢拉定、头孢美唑、庆大霉素、丁胺卡那、诺氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、四环素多西环素共11种抗菌药物均高度敏感，对亚胺培南、林可霉素、青霉素均产生了耐药(表2)。

表2 药敏试验结果

注：“R”表示耐药；“I”表示中度敏感；“S”表示高度敏感。

Note:“R”means resistance；“I”means intermediate；“S”means high sensitiviry.

3 讨论

由多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌引起的山羊肺炎在临床症状上与其他多种病因引起的肺炎难以区别，因此应用细菌分离、培养特性和染色特性鉴定结合PCR鉴定是确定是否存在上述两种病原菌的有效方法。细菌分离时，根据细菌染色特性与菌落形态特征可初步判断细菌类型，本研究分离到的两种细菌的染色特性以及分离菌在含100 mL/L马血清的TSA平板上的菌落形态符合多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的特征，其中，分离的溶血性曼氏杆菌能在麦康凯平板上生长，且与溶血性曼氏杆菌在麦康凯平板上生长的特征完全符合，而分离的多杀性巴氏杆菌在麦康凯平板上不生长。2种分离菌的特征与李浩等(2011)和王羽等(2016)报道的引发山羊肺炎的主要病原菌的特征一致。PCR作为一种快速检测技术以其快速、灵敏等优势在病原的鉴定中得到了广泛的应用。为了进一步确定分离的病原菌，本研究以多杀性巴氏杆菌的kmt特异性基因和溶血性曼氏杆菌的Lkt特异性基因引物经PCR鉴定分离的2种细菌，结果表明，经2种细菌的特异性引物PCR扩增的目的基因与预期目的基因一致，可确定2种分离菌分别为多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。表明多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌是导致该山羊肺炎病例的重要病原菌。

本研究中多杀性巴氏杆菌在血平板上呈露滴状、光滑的不溶血小菌落。这与马晓菁等[16]所做多杀性巴氏杆菌溶血性试验结果一致。根据多杀性巴氏杆菌不同的菌株在血琼脂培养基上形成的菌落形态不同，一般认多杀性巴氏杆菌的光滑型(S型)菌株对小鼠的毒力最强[17]。本试验所分离的多杀性巴氏杆菌平板培养物是一种光滑型菌落，致病性试验表明，该菌能快速致死Balb/c小鼠。溶血性曼氏杆菌所有血清型菌株都能产生白细胞毒素，有溶血性，本试验中分离的溶血性曼氏杆菌呈β溶血。通常认为致β溶血的菌株均具有较强的致病性，本研究分离鉴定的溶血性曼氏杆菌能快速致死Balb/c小鼠，是具有较强致病性的菌株。本研究分离鉴定的两种细菌均能快速致死试验小鼠，是引起山羊死亡的重要病原菌。

有效的抗菌药物是治疗细菌感主要的手段。本研究选取了19种抗菌药物对2种病原菌进行药物敏感性试验，结果显示2种病原菌对头孢噻肟、头孢唑林、头孢拉定、头孢美唑、庆大霉素、丁胺卡那、诺氟沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、四环素、多西环素11种抗菌药物高度敏感，该试验结果为合理选用敏感抗菌药物治疗多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌性羊肺炎提供了依据。