青蒿总黄酮联合有氧间歇运动训练抑制肝纤维化小鼠模型炎症反应

成嘉祁，龚芸芸，谢海静，李宏亮，戚龙菊

(1.南通大学医学院，江苏南通 226001；2.南通大学杏林学院，江苏南通 226001；3.南通市第三人民医院，江苏南通 226001；4.南通大学护理学院，江苏南通 226001)

美国2017年癌症报告显示，年度新增肝胆癌症患者40 710人(男性29 200人，女性11 510人，死亡人数为28 920人(男性19 610人，女性9 310人)，死亡率占肿瘤死亡率的4.813%[1]。我国是肝癌高发的国家之一，每千人中年度新增患者466.1人(男性343.7人，女性122.3人)，年度死亡人数为422.1人(男性310.6人，女性111.5人)，占肿瘤死亡率的10.861%[2-3]。肝纤维化(Hepatic fibrosis)常见于肝脏慢性损伤后的修复过程，由于细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成高于降解，进而过度沉积，破坏肝脏结构和功能，导致肝脏衰竭，并逐步向肝硬化和肝癌发展，预后极差[4]。由于早期诊断手段的缺乏以及症状不易察觉，导致大多数肝病患者就诊时已经出现肝硬化甚至肝癌症状，给家庭和社会医疗体系造成较大的负担，而国内外目前尚未有有效的治疗药物方法[5-6]。

肝脏的损伤和纤维化会导致脏器局部循环减弱，产生缺氧而促进病程的恶化[7-9]。低氧环境和组织纤维化诱导炎症反应的产生，而炎症又加重缺氧，因此控制局部炎症反应对于治疗和逆转肝纤维化十分必要[10-12]。康复治疗手段在临床上已逐步应用于肿瘤患者的辅助治疗[13-15]，并在动物肿瘤模型中获得了验证[16-17]。其中采用不同运动负荷组合交替进行，组间充分休息的有氧间歇运动训练(aerobic interval training，AIT)可以促进肝脏局部供氧，改变代谢方式，有效缓解肿瘤患者疲劳，但其在肝纤维化过程中的作用机制并未研究清楚[7,18-19]。总黄酮具有抗氧化、抗炎症、抗病毒等作用，已有研究报道表明枳椇子、欧芹根、黄芪及荔枝等植物总黄酮具有治疗病毒性和酒精性肝炎的作用[20-22]。青蒿素抗疟效果显著，随之对青蒿提取物研究方兴未艾，但青蒿总黄酮是否对肝纤维化具有抑制作用并未见报道。本研究以肝纤维化小鼠为模型，利用青蒿总黄酮联合有氧运动的治疗方案，观察二者单独及联合使用对小鼠肝纤维化的保护作用及其对炎症因子水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 青蒿总黄酮为西安赛邦医药科技有限公司产品；ConA为美国Sigma公司产品；实时荧光定量PCR试剂盒、逆转录试剂盒及Trizol为南京诺维赞生物技术有限公司产品；Masson染色试剂盒为索莱宝生物科技有限公司产品；IL-1β、IL-10、IL-6以及TNF-α检测试剂盒为武汉优尔生公司产品；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.2 仪器 小鼠实验跑台(ZH-PT)，安徽正华生物仪器有限公司，实时荧光定量PCR仪，Applied Biosystems，Eppendorf冷冻离心机，酶标仪。

1.1.3 实验动物 健康雄性SPF级Balb/c小鼠60只，4周龄，体重20 g～22 g，购自南通大学实验动物中心。正常饲养3 d以适应环境。5只/笼，相对湿度40%～70%，12 h/12 h明暗周期光照，温度为22℃～25℃，自由采食和饮水。实验动物饲养及取材操作规程获得南通大学实验动物管理委员会的批准，并严格遵守。

1.2 方法

1.2.1 造模 以12.5 μg/g体重剂量每周一次尾静脉注射ConA的氯化钠溶液，持续8周，最终存活个体作为实验对象。随机抽取3只小鼠进行肝纤维化评价以确定是否造模成功。

1.2.2 分组与给药 造模成功后小鼠40只随机平均分为总黄酮组(FLA组)，运动组(TM组)，混合治疗组(FTM组)，模型组(Model组)。FLA组0.4 mg/g剂量于每日上午进行灌胃；TM组采用AIT方案进行跑台；FTM组于每日上午以0.4 mg/g的剂量灌胃，下午进行AIT跑台，运动方案同TM组；Model组正常饲养。共持续6周。

1.2.3 运动方案 AIT处理的小鼠在实验前以10 m/min步速训练5 d，并测定最大跑速(Maximal speed)。小鼠先以10 m/min速度热身5 min，随之跑台速度以3 m/min增加直至小鼠出现运动失调，疲劳症状，以之为最大跑速。实验开始后，TM和FTM组小鼠以最大跑速的60%运动60 min，5 d/周，持续6周[23]。

1.2.4 动物样本取材 30 mL/L的水合氯醛麻醉小鼠，心脏采血1 mL，室温静置30 min，3 000 r/min离心10 min，取上层血清，置-80℃备用；颈椎脱臼处死小鼠，开腹，取肝脏组织100 mg，生理盐水冲洗，置于1.5 mL离心管中，加入1 mL的Trizol，液氮冷冻，置-80℃备用；取肝脏组织300 mg，生理盐水冲洗，置于40 mL/L PFA中固定，次日行脱水，透明，浸蜡包埋，做5 μm切片。

1.2.5 Masson染色 烘片2 h，梯度入水。临用时取等量的Weigert染液A与Weigert染液B混合成为铁苏木素染液，染色6 min；酸性乙醇分化30 s，水洗后返蓝1 min，水洗1 min；丽春红品红染色5 min，用弱酸工作液浸泡1 min；磷钼酸溶液洗2 min，弱酸溶液浸泡1 min；苯胺蓝染色4 min。弱酸溶液浸泡1 min；用950 mL/L乙醇迅速脱水；无水乙醇， 30 s×3；二甲苯，5 min×3；封片并镜检。

1.2.6 ELISA检测 IL-1β、IL-10以及TNF-α检测按照试剂盒所提供说明书进行操作[24]。

1.2.7 Real-time PCR检测 常规Trizol-氯仿法提取各组动物肝脏RNA，逆转录成cDNA后作为模板，用荧光定量PCR反应Kit对IL-1β、IL-10、IL-6以及TNF-α表达量进行检测。反应程序为:94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，总循环40次。从NCBI下载基因序列，使用Primer 6.0进行引物设计，BLAST预测扩增特异性。引物序列见表1。

1.2.8 统计分析 采用SPSS22.0分析检测所得结果。各组中死亡小鼠不计入统计量。多组间均数比较采用方差分析；用t检验方差齐性，不齐者采用矫正t检验；对变异较大组比较采用秩和检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

表1 引物序列

2 结果

2.1 肝脏纤维化程度的变化

各组小鼠肝切片Masson染色结果显示，Model组小鼠肝脏中胶原纤维(蓝色)表达量显著增多，呈现弥漫性，并且互相粘连成片，形成区域斑块样分布，又以血管周围和汇管区为主；FLA组蓝色纤维分布较少，主要集中于汇管区和血管周围，但红色的肌纤维呈点状分布；TM组中蓝色胶原纤维表现为散发性分布，但并未粘连成片，未见斑块样区域；FTM组肝脏组织中偶见些许蓝色纤维，并且纤维长度较短，宽度较窄(图1)。

2.2 肝脏组织中炎症因子转录水平的变化

实时定量荧光PCR结果表明，与Model组相比，FLA组TNF-α的表达量显著下降(P<0.01)，TM组显著下降(P<0.05)，而FTM组中则极显著下降(P<0.001)。与FLA组相比，FTM组中TNF-α的表达量显著下降(P<0.05)，与TM组相比，FTM组表达量则极显著下降(P<0.01)；与Model组相比，FLA组及TM组中IL-1β的表达量显著下降(P<0.05)，而FTM组中则极显著下降(P<0.01)。与FLA组及TM组相比，FTM组中IL-1β的表达量显著下降(P<0.05)；与Model组相比，FLA组、TM组及FTM组中IL-6的表达量均显著下降(P<0.05)，与FLA组及TM组相比，FTM组中IL-6的表达量均显著下降(P<0.05)；与Model组相比，FLA组及TM组中IL-10的表达量显著上升(P<0.05)，而FTM组中则极显著上升(P<0.01)。与FLA组及TM组相比，FTM组中IL-10的表达量显著上升(P<0.05)(表2)。

A.模型组小鼠肝脏切片Masson染色(40×)，比例尺=50μm; B.黄酮组小鼠; C.运动组小鼠; D.复合组小鼠，放大倍数及比例尺同A.

A.Masson staining of the liver sections in model group mice (x40),scale bar=50 μm; B.FLA group; C.TM group; D.FTM group,the parameters were same as A.

图1各组小鼠肝脏Masson染色(40×)

Fig.1 Masson staining of liver sections in mice of different groups(40×)

2.3 血清中炎症因子含量的变化

ELISA结果表明，与Model组相比，FLA组及TM组血清中TNF-α的含量均极显著下降(P<0.01)，而FTM组则呈现极显著差异(P<0.001)。与FLA组和TM组相比，FTM组血清中TNF-α的含量差异显著(P<0.05)；与Model组相比，FLA组中IL-1β的含量极显著下降(P<0.01)，TM组中显著下降(P<0.05)，而FTM组中则极显著下降(P<0.001)。与FLA组相比，FTM组中IL-1β的含量显著下降(P<0.05)，与TM组相比，FTM组含量极显著下降(P<0.01)；与Model组相比，FLA组及TM组中IL-10的表达量显著上升(P<0.05)，而FTM组中则极显著上升(P<0.01)。与FLA组及TM组相比，FTM组中IL-10的含量显著上升(P<0.05)(表3)。

表2 各组小鼠肝脏组织中炎症因子转录水平的变化

注：与模型组比较：1.P<0.05，2.P<0.01 ，3.P<0.001 ；与黄酮组比较：4.P<0.05；与运动组比较：5.P<0.05，6.P<0.01。

Note:Compared with the model group,1.P<0.05,2.P<0.01,3.P<0.001; Compared with FLA group,4.P<0.05; Compared with the TM group,5.P<0.05,6.P<0.01.

表3 各组小鼠血清中TNFα、IL-1β、IL-10含量的变化

注：与模型组比较：1.P<0.01，2.P<0.001 ；与黄酮组比较：3.P<0.05；与运动组比较：4.P<0.05，5.P<0.01。

Note:Compared with the model group,1.P<0.05,2.P<0.01; Compared with the FLA group,3.P<0.001; Compared with the TM group,4.P<0.05,5.P<0.05.

3 讨论

肝癌是世界上第二致死病因，每年全球有超过70万人因此而死亡[25]。肝癌的发生过程中，肝脏纤维化是关键的转折点，并且肝纤维化评分与肝脏疾病、肝癌发生率以及死亡率呈正相关，因此肝纤维化程度能够预示肝癌发生率[26]。肝脏纤维化往往会由于病毒、酒精、药物以及遗传因素等原因导致肝脏损伤，造成肝脏内结缔组织异常增生，进而使得弥漫性细胞外基质在肝脏内部过度沉积[27]。纤维化通常是各种慢性肝脏疾病发展的共同结果，也是肝硬化的必经阶段，更是肝细胞癌的前兆和关键节点[28]。由于肝脏纤维化是一个可逆的过程，故监测和治疗肝纤维化过程成为攻克肝癌的重要环节。活化的肝脏星状细胞是肌成纤维细胞主要来源，肝脏中肌成纤维细胞通过合成并分泌胶原促进肝脏细胞外基质的积累，导致肝纤维化的发生[28]。通过Masson染色可以清晰观察到各组小鼠肝脏中胶原纤维的发生情况，模型组纤维化程度最高，总黄酮和运动干预能够有效降低纤维化程度，但二者联合使用抵抗肝脏纤维化能力显著增强。

中药在慢性病的治疗过程中具有独特的优越性，肝纤维化在中医中被认为是由于肝郁气滞导致血瘀的产生，而血不养肝，因此需要清热解毒，散淤消肿。鬼针草中黄酮类物质能够显改CCl4引起的大鼠肝纤维化程度，抑制星状细胞的活化和增殖[29]。赶黄草总黄酮能够抑制大鼠酒精性肝纤维化，降低组织中过氧化物活性和浓度，抑制炎症因子的表达[30]。青蒿提取物能够抑制炎症反应而诱导肝癌细胞的凋亡[31]，但青蒿总黄酮的功能并不清楚。本研究表明，青蒿总黄酮能够有效抑制肝脏纤维化，并抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，提高抗炎因子IL-10的表达。

临床早期康复训练能够改善乳腺癌患者术后体征指数[13,16]，并提高肝癌患者术后的排气和焦虑状态[14]，但康复训练，尤其是AIT对于肝纤维化改善机制研究并不清楚。本研究中AIT能够有效抑制刀豆蛋白A所导致的肝脏纤维化，但治疗效果低于青蒿总黄酮组，可能是AIT只进行了6周，时间较短的缘故，尚需更长时间AIT进一步验证。AIT和青蒿总黄酮联合处理肝纤维化小鼠模型能够有效遏制肝纤维化的进程，并促进逆转过程，主要体现在胶原纤维长度缩短，体积变小。运动康复改善肝纤维化进程的机制也可能是通过抑制局部以及全身性炎症反应而发挥作用的，局部转录水平检测表明肝脏原位炎症因子的表达水平被AIT显著抑制，但抑制效果显著低于联合组，可能延长训练时间会获得更好的效果。AIT也能够显著抑制全身性炎症免疫应答，血清中促炎因子TNF-α和IL-1β显著下降，而抗炎症因子IL-10含量则显著升高。这也提示AIT在肝纤维化治疗中与中药相结合也许会增加临床效用。

综上所述，青蒿总黄酮联合有氧间歇运动训练具有更加明显拮抗及逆转肝脏纤维化的作用，进而阻止其进一步发展为肝硬化。青蒿总黄酮联合AIT可以通过降低肝脏局部及外周血中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，促进抗炎因子IL-10的表达，降低局部炎症反应，减轻肝脏损伤，进而发挥治疗肝纤维化的效应。