北方根结线虫对花生黄曲霉菌及其毒素污染的影响

郭志青，沈 浦，许曼琳，张 霞，于 静，李 莹，何 康，刘 峰，宋新颖，韩金涛，迟玉成*

(1.山东省花生研究所，山东 青岛 266100； 2.山东农业大学植物保护学院，山东 泰安 271018； 3.山东省农药科学研究院，山东 济南 250033)

黄曲霉毒素是由黄曲霉菌(Aspergillusflavus)、寄生曲霉菌(A.parasiticus)、集蜂曲霉菌(A.nomius)等曲霉菌产生的一类有毒次级代谢产物[1]，此类曲霉菌及其毒素能够污染玉米[2]、花生[3]、油料[4]、香料[5]、坚果[6]等多种农产品。在不同暴露时间和剂量情况下，黄曲霉毒素会对人和动物产生不同程度的影响如急性或慢性中毒、致癌、致畸形和致突变等[7]，且具有一定的免疫抑制性和基因毒性[8]。目前已知存在黄曲霉毒素有18种，包括四种最常见的自然发生的黄曲霉毒素：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2以及主要代谢产物黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2等[9]，它们是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，具有双呋喃环和氧杂萘邻酮的结构[10-11]。

花生地上开花、地下结果的特性使其果实在整个生长周期都容易被土壤中的黄曲霉菌和寄生曲霉菌侵染，此两种霉菌通常以分生孢子或菌核在土壤中越冬，其菌丝体附着在作物的残骸上越冬。来年花生播种后，随着环境温湿度适宜于孢子萌发，霉菌开始生长、繁殖，并侵染花生的不同组织和器官。在黄曲霉菌丰度相同的花生种植地块，收获前的花生受污染程度主要取决于花生品种不同导致的遗传抗性不同，从而影响花生黄曲霉菌及其毒素污染水平[12]。土壤中黄曲霉菌的含量对收获前花生的污染程度也有非常重要的影响，发生侵染的黄曲霉菌主要来源于土壤，已有报道证明土壤中黄曲霉菌的含量与收获前花生受污染程度成正相关[3]。除此之外气候条件、病虫害、花生收获时间和收获时的成熟度对花生受黄曲霉菌的污染也有很大的影响[13]。收获后的污染主要是与花生收获操作过程中造成的机械损伤、干燥不充分或不及时以及贮藏过程中环境温度、湿度以及含氧量等有关。

根结线虫(Meloidogynespp.)是一类非常重要的植物病原线虫，主要通过土壤进行传播，有着很强的适应和繁殖能力，寄主广泛，其引起的危害在世界各地均有发生，造成作物的大规模减产和经济损失。其中南方根结线虫(M.incognita)、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)和北方根结线虫(M.hapla)是四种危害花生最为重要的根结线虫[14]，且在我国分布最为广泛。北方根结线虫是花生根结线虫病的主要病原物，花生根部遭侵染后，根系吸收功能被破坏，造成花生严重减产[15]。

目前，北方根结线虫对花生受黄曲霉菌及其毒素污染的影响鲜有报道。Minton等人研究过接种A.flavus、接种A.flavus+M.hapla两种处理花生的黄曲霉菌侵染率，数据显示后者处理样品花生籽仁的黄曲霉菌侵染率明显高于前者，研究的不足之处是他们没有给出对照和只接种M.hapla的数据[16]。为更全面地统计不同处理条件下黄曲霉菌的侵染率，本试验应用对花生北方根结线虫抗(感)性不同的花生品种分别设4个处理，旨在研究不同抗(感)性花生品种受北方根结线虫侵染后，其果壳和籽仁的黄曲霉菌侵染率及籽仁中黄曲霉毒素的变化。明确北方根结线虫对黄曲霉侵染花生的影响，可以更好地降低花生采收前黄曲霉毒素的污染，提出相应的防控措施，对提高花生的品质和产量有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所需花生品种D029、花育33(HY33)分别属中抗(MR)、高感(HS)根结线虫的品种[17]。

1.2 方 法

1.2.1 微区池栽试验设计及收获样品的处理

微区池栽试验于2019、2020年在山东省花生研究所莱西试验站大棚内进行。池栽试验更接近田间的实际情况，又能保护其他试验田不被线虫和黄曲霉菌污染，便于土壤消毒。池栽试验采用裂区设计，以品种为主区，以接种黄曲霉菌和北方根结线虫处理为裂区，共8个处理，重复3次。收获后的样品初步分成饱果和秕果进行果壳、籽仁黄曲霉菌侵染率和籽仁黄曲霉毒素含量测定。

池栽试验微区为砖水泥结构，长宽高分别为1.0 m×1.0 m×0.8 m，填入沙土与少量有机质的混合物。播种前两个月，将所有试验微区用氯化苦彻底熏蒸。微区种植方式：不起垄，不覆膜种植。田间管理：花生生长期间不使用杀虫、杀菌剂及生长抑制剂，人工除草，一周浇一次水(滴灌)。

1.2.2 池栽试验黄曲霉菌及根结线虫的接种

花生播种后60 d接种黄曲霉菌：首先，产毒黄曲霉菌NRRL3357在燕麦粒上培养14 d，将10粒燕麦撒施于池栽花生的茎基部表土里，接种后滴管给花生连续浇水3 d，以保证湿润的微环境利于黄曲霉菌的侵染。北方根结线虫的接种：花生播种前，每棵花生接种8 000粒北方根结线虫的卵[18]。荚果成熟后收获时，计算不同处理花生果壳和籽仁黄曲霉菌的侵染率及籽仁中黄曲霉毒素的含量。

北方根结线虫病微区抗性鉴定判别标准参照宋协松等[19]的方法，并根据试验情况略做改进。主要以发病严重程度为依据，分5个类型。免疫：病情为0级；高抗：病情1级以下；中抗：病情1～2级；中感：病情2～3级；高感：病情3级以上。

1.2.3 花生果壳和籽仁中黄曲霉菌侵染率检测

对不同处理的D029和HY33花生收获晒干后，每个样品取20个花生双仁荚果，将荚果掰开，取一半果壳和一粒花生米，在生物安全柜中用1%次氯酸钠表面消毒3 min，处理样品晾干后，分别接种于WA培养基上，28℃培养箱内黑暗培养6 d。果壳或籽仁上长有黄色孢子的菌落在PDA培养基平板上进行分离纯化，直至得到单个菌落。对单菌落进行形态学和分子生物学鉴定。

花生果壳和籽仁中黄曲霉菌的侵染率是每个处理20个样品中能够分离出黄曲霉的样品占总样品的百分数，统计数值后进行分析。

1.2.4 花生黄曲霉菌分离纯化和鉴定

① 黄曲霉菌的形态学鉴定：采用琼脂平板表面单孢子挑取法，挑取单个菌落的菌株于PDA 培养基上，于28℃培养3 d后在显微镜(OLYMPUS，日本PD80)下进行形态学观察分生孢子的形态。

② 黄曲霉菌DNA的提取：黄曲霉基因组DNA用UNIQ-10柱式真菌基因组抽提试剂盒(生工生物，上海)提取。具体操作步骤参照郭志青等[2]，提取到的DNA置于4℃冷藏。

③ 黄曲霉菌的分子生物学鉴定：对形态学初步鉴定获得的菌株，利用 ITS(Internal Transcribed Spacer)特异性引物ITS1(5’-3’)：TCCGTAGGTGAACCTGCGC，ITS4(5’-3’)：TCCTCCGCTTATTGATATGC序列分析[20]，通过凝胶电泳判断PCR扩增片段的长度并对PCR产物进行测序，与已发表的黄曲霉菌片段长度和序列进行比对，进一步鉴定菌株。

1.2.5 黄曲霉毒素含量检测

将20 g不同处理花生籽仁(饱果和秕果)粉碎，使其可以通过20目筛，采用间接酶联免疫的方法，按照华安麦科黄曲霉总量试剂盒说明书检测方法进行黄曲霉毒素含量检测。具体操作步骤参照郭志青等[3]。

1.3 数据分析

运用SPSS v26.0软件对试验数据进行统计分析，应用LSD-t法分析D029、HY33饱果、秕果(对照组vs接种北方根结线虫处理；只接种黄曲霉vs接种黄曲霉+北方根结线虫处理)果壳黄曲霉菌侵染率、籽仁黄曲霉菌侵染率、籽仁中黄曲霉毒素的含量数据，分析北方根结线虫对花生黄曲霉菌及其毒素污染的影响。

2 结果与分析

2.1 花生果壳及籽仁上黄曲霉菌的培养及分离纯化

将不同处理花生果壳和籽仁进行培养(图1)并对真菌进行分离纯化，在PDA培养基平板上，肉眼观察能产黄色孢子的菌落，进一步二次挑单孢培养得到单菌落。

2.2 黄曲霉菌的形态学鉴定

将分离纯化的菌株在显微镜下观察其分生孢子、分生孢子梗的形状(图2)。分生孢子梗顶端膨大成圆形或椭圆形，上面着生1～2层放射状分布的瓶状小梗，内壁芽生式分生孢子聚集在分生孢子梗顶端成头状，初步鉴定为黄曲霉菌。

2.3 黄曲霉菌的分子生物学鉴定

利用真菌 ITS 鉴定方法，用通用引物ITS1/ITS4扩增黄曲霉菌基因组DNA的ITS序列[19]，PCR 产物片段大小约600 bp，将PCR产物送生工生物测序，将序列在NCBI数据库中比对，其序列与黄曲霉菌NRRL3357菌株的相似度最高，为100%，确定分离到的真菌为黄曲霉菌。

2.4 不同处理花生结果及根结线虫侵染情况

对照组花生植株(图3A)荚果数量明显多于处理组(图3B，3C，3D)，且秕果较少；只接种黄曲霉菌的植株根部(图3B)未发现明显的北方根结线虫的侵染(虫瘿)；只接种北方根结线虫的花生植株根部(图3C)有明显的北方根结线虫的虫瘿，花生荚果的数量较对照明显减少，并且花生秕果的数量相对较多；接种黄曲霉菌+北方根结线虫的植株根部(图3D)有明显的北方根结线虫的虫瘿，花生荚果的数量是四组处理中最少的，并且花生秕果的数量相对较多。

2.5 不同处理花生果壳黄曲霉菌侵染率

分别对2019、2020年花生品种D029和HY33不同处理的96个样品(包括饱果和秕果)的果壳进行黄曲霉菌侵染率统计。果壳黄曲霉菌侵染率结果如图4所示，供试的2个品种处理中，接种黄曲霉菌处理和接种黄曲霉菌+北方根结线虫处理的花生果壳黄曲霉菌的侵染率较高，可达到100%；在对照处理(CK)中，感线虫品种HY33饱果果壳黄曲霉菌侵染率(65%±10%)高于D029饱果果壳黄曲霉菌侵染率(25%±5%)；同一品种果壳黄曲霉菌侵染率数据显示，D029对照组秕果黄曲霉菌侵染率(55%±10%)高于对照组饱果黄曲霉菌侵染率(25%±5%)。通过花生果壳黄曲霉菌侵染率的数据可知：在同样试验处理条件下，根结线虫高感品种(HY33)花生果壳黄曲霉菌侵染高于根结线虫中抗品种(D029)；供试的两个花生品种，对照组和接种根结线虫处理秕果的黄曲霉菌侵染率高于饱果的黄曲霉菌侵染率。

2.6 不同处理花生籽仁黄曲霉菌侵染率

分别对2019、2020年花生品种D029和HY33不同处理样品的籽仁(饱果内籽仁和秕果内籽仁)进行黄曲霉菌侵染率的统计，饱果籽仁黄曲霉菌侵染率数据如图5所示，与果壳黄曲霉菌侵染率的趋势相同，接种黄曲霉菌处理的花生籽仁的侵染率较高，可达到50%±5%，HY33品种籽仁黄曲霉菌侵染率显著高于D029；秕果籽仁黄曲霉菌侵染率结果显示，秕果籽仁的黄曲霉菌侵染率高于饱果籽仁的侵染率。同一品种和相同处理的花生果壳的黄曲霉菌侵染率高于籽仁黄曲霉菌侵染率。运用SPSS分析软件通过LSD-t检验，发现D029籽仁饱果样品中，接种线虫的籽仁的侵染率显著高于对照组(P=0.043)；同时接种北方根结线虫+黄曲霉菌的籽仁黄曲霉菌侵染率显著高于只接种黄曲霉菌的样品(P=0.035)。同样的规律存在于HY33籽仁饱果、D029籽仁秕果和HY33籽仁秕果样品中。

2.7 花生籽仁中黄曲霉毒素的测定

分别对2019、2020年花生品种D029和HY33不同处理的样品(饱果和秕果)进行籽仁黄曲霉毒素的测定，籽仁黄曲霉毒素数据如图6所示，2个接种黄曲霉菌+北方根结线虫处理的花生品种籽仁的黄曲霉毒素的含量均高于只接种黄曲霉菌的处理，可达到65.07±12.70 μg/kg，HY33籽仁黄曲霉毒素含量高于D029；数据显示，秕果籽仁的黄曲霉毒素含量高于饱果籽仁的黄曲霉毒素含量。

3 讨 论

本研究通过将饱果和秕果分开检测，旨在减少实验样品选取时的误差，同时检测饱果和秕果的果壳、籽仁黄曲霉菌侵染率及黄曲霉毒素含量的差异，对农食产品加工产业提供理论参考。此外，我们分析了北方根结线虫对抗(感)花生品种D029(中抗)、HY33(高感)黄曲霉菌侵染率及黄曲霉毒素积累的影响，试验结果可知：HY33果壳和籽仁黄曲霉菌的侵染率及籽仁黄曲霉毒素含量均高于D029，推测抗线虫花生品种是影响黄曲霉菌侵染率和黄曲霉毒素污染严重程度的关键因素之一。因此，建议种植户在根结线虫发生严重的地块种植抗根结线虫的花生品种，从而减少黄曲霉菌及黄曲霉毒素的污染，提高花生的产量和品质。

试验结果中，我们发现接种线虫处理的花生果壳、籽仁黄曲霉菌侵染率高于对照组，数据结果跟Minton等分析数据一致[16]。可能的原因有：① 北方根结线虫在花生果壳上造成的伤口有利于黄曲霉菌的侵染；② 根结线虫对根部组织造成伤害，影响根的正常机能，导致花生植株的生长势削弱，容易受到黄曲霉菌的侵染；③ 根结线虫对根的伤害影响了花生植株对营养的吸收，降低了花生植株的抵御能力，有助于黄曲霉菌等病原微生物的侵染。李绍伟等在分析开封地区花生根结线虫的发生危害时，也指出线虫侵入花生根部造成根液渗流，损耗细胞养分，容易引起次生病害[21]，这也解释了本实验结果中同时接种北方根结线虫和黄曲霉菌会加重黄曲霉菌及其毒素的污染。

试验数据中，同一花生品种、同一处理的样品，花生籽仁黄曲霉菌的侵染率低于果壳，分析原因可能是花生果壳对籽仁有很好的保护作用，减少了黄曲霉菌侵染籽仁的机率，因此，建议在条件允许的情况下，花生尽量带壳储藏和长途运输，避免此过程中因湿度和水活性增大引起孢子萌发，此措施可以有效降低黄曲霉菌侵染率，从而降低黄曲霉毒素污染，保证籽仁及其加工产品的品质安全。此外，种植果壳强度适宜的花生品种会减轻黄曲霉菌在采前或采后对花生的侵染。

通过本研究提出如下防控花生黄曲霉菌及产生黄曲霉毒素污染的措施： ① 种植抗线虫病品种是防治花生线虫病最为经济有效的途径，既可以降低农业成本，增加作物产量，又可以避免大量使用化学农药对环境造成的污染。选用种植抗北方根结线虫的花生品种，如D099，D015等[17]。抗黄曲霉毒素花生品种培育和筛选主要包括两种形式：一种是抗黄曲霉菌侵染型，黄曲霉菌在此类花生品种中很难侵染和繁殖；另一种是抗黄曲霉菌产毒型，不抑制黄曲霉菌生长，但是抑制黄曲霉毒素的产生[22-23]。② 通过生物熏蒸和深耕防控线虫。玉米等前茬作物收获后立即种植高硫甙芥菜，并于11月下旬打碎深翻到土壤里[24]。芥菜能够产生有机挥发物，可抑制线虫的繁殖，是替代土壤化学熏蒸的一种生态防治技术，兼具土壤改良、绿肥、有机肥、克服连作障碍与线虫病害防治等功效[25]。③ 有条件的地块与非豆科作物轮作或套种，如与小麦、玉米、高粱、谷子等轮作或套种2年以上，轮作或套种时间愈长，防治花生线虫病害的效果愈明显。④ 播种期施用生物菌肥。花生播种时，应用淡紫拟青霉和厚垣孢子轮枝菌等生物制剂，能明显起到降低线虫群体和消解其卵的作用，对根结线虫也有较好的控制效果[26]。

以上措施主要通过防控根结线虫达到减少收获前花生黄曲霉菌及其毒素污染的目的。此外，花生在生育期和收获后还受环境条件影响，比如种植田块产毒菌株群体的比例，若产毒群体比例高，则会加大花生黄曲霉毒素污染的机率，因此要在播种前熏蒸或杀菌；荚果充实期间应避免中耕除草，防止人为损伤，以及避免在土温较高时灌水，防止因土温骤降而使荚果破裂，增加因伤口引起的黄曲霉菌侵染的机率；花生生育后期和荚果发育期(收获前4～6周)遇旱要及时灌溉，避免干旱胁迫引起黄曲霉菌及其毒素污染；花生储藏期要严格控制水分，降低原料入库时的水分含量，尽量将水分控制到安全水平(籽仁8%～9%，荚果10%) 以内。