固相萃取-气相色谱法测定茶叶中氟环唑

李峥嵘，黄晓东

(安徽工程大学 生物与化学工程学院，安徽 芜湖 241000)

氟环唑(epoxiconazole)，分子式C17H13ClFN3O，是德国巴斯夫公司研发的内吸型、长效、低毒三唑类含氟杀菌剂，在预防和防治一系列禾谷类作物病害方面取得了良好效果[1-2]． 近年来随着三唑类杀菌剂的使用和乱用，对生态环境造成极大危害[3-4]．2015年，氟环唑被欧盟划分为“(1类、2类)生殖毒性”和“(2类)致癌”的农药[5]．欧盟规定了氟环唑在茶叶上的MRLS(最大残留量)值为0.05 mg/kg．目前我国在此方面无明确规定，可能会导致我国茶叶出口在欧盟受阻，故研究氟环唑残留量检测方法具有现实经济意义．

目前对氟环唑残留量的检测大多数集中在蔬菜和谷物中，检测方法有UPLC-MS/MS[6-9]，GC-MS/MS[10-11]等．茶叶中的氟环唑残留分析净化多用中性氧化铝[12]、GCB柱(石墨化炭黑)[13]、TPT混合填料柱[14-15]、GPC(凝胶渗透色谱)[16]以及QuEChERs(分散固相萃取)[17]等净化方法，以上方法均可靠，但步骤较为繁琐．实验采用Florlisil柱-气相色谱法检测茶叶中氟环唑残留量，简化了前处理步骤，提高了实验精确性和稳定性，是有效监督控制氟环唑残留量的检测方法．

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿茶，产自芜湖；乙腈、丙酮、正己烷、甲醇、氯化钠(色谱纯或分析纯)；C18萃取柱；NH2萃取柱；Florlisil柱；氟环唑标样(浓度≥99%，德国Dr.Ehrenstorfer)；超纯水．

1.2 仪器与设备

GC-2010气相色谱仪(配有ECD)(日本岛津公司)；VX-200涡旋混合器(美国Labnet)；旋转蒸发浓缩仪(上海弘懿仪器设备有限公司)；TGL-16G离心机(上海安亭仪器厂)．

1.3 实验方法

(1)气相色谱条件.色谱柱：DB-17柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；温度：INJ为250 ℃ ；DET为300 ℃；COL为180 ℃(1 min)，8 ℃/min ，250 ℃(10 min)；载气 ：高纯氮气 ，柱流量 2.0 mL/min；进样方式：不分流，进样量1 μL．

(2)标准曲线的绘制.准确称取10 mg氟环唑标准品，用正己烷溶解配制成1.0 mg/mL的氟环唑标准储备母液(不用时置于-18 ℃以下冰箱避光储存)和0.01 mg/mL的氟环唑储备液(不用时置于0 ℃～4 ℃冰箱避光储存)．用正己烷稀释成1.0 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.06 μg/mL、0.02 μg/mL的氟环唑标准溶液，在选定色谱条件下进行GC-ECD检测，并计算氟环唑标准曲线线性关系方程．

(3)样品前处理．用粉碎机将茶叶粉碎成末，过100目筛．称取1.0 g茶叶粉样品于50 mL加盖离心管中，加入18 mL乙腈和0.4 g NaCl，涡旋混匀，超声辅助提取12 min，8 000 r/min离心10 min，转移上清液至鸡心瓶中，真空旋转浓缩近干，加入5 mL正己烷-丙酮(7+3)超声溶解，上样至Florlisil柱+GCB混合柱，接出流出液，再每次用2 mL正己烷-丙酮(7+3)3次清洗鸡心瓶，并将洗涤液加入柱中，继续加入20 mL正己烷-丙酮(7+3)洗脱，旋转浓缩近干，其后加入1 mL甲醇-水(9+1)超声溶解，涡旋混匀，过0.22 μm滤膜转移至进样瓶，供GC-ECD分析．

(4)固相萃取条件选择．

①提取剂的选择．准确称取4组相等的茶叶样品，同时添加质量浓度为0.05 mg/kg的氟环唑标准液，分别用正己烷、乙腈、丙酮和甲醇作为提取剂，在其他实验条件保持不变的情况下，按照上述步骤进行样品前处理，供GC-ECD分析，计算回收率，确定提取剂的种类．

②提取剂体积的选择．准确称取5组相等的茶叶样品，同时添加质量浓度为0.05 mg/kg的氟环唑标准液，只改变提取剂的体积，分别用10 mL、15 mL、20 mL、25 mL和30 mL选定的提取剂提取，计算回收率，确定提取剂的体积．

③NaCl加入量的选择．准确称取5组相等的茶叶样品，同时添加质量浓度为0.05 mg/kg的氟环唑标准液，只改变NaCl固体加入量，NaCl加入量分别为0.0 g、0.4 g、0.8 g、1.2 g、1.6 g，计算回收率，确定NaCl加入量．

④超声处理时间的选择．为了使净化效果达到最佳，实验采用超声辅助的方法，超声时间分别设定为0 min、5 min、10 min、15 min和20 min，其他条件不变，计算回收率，确定超声处理时间．

⑤洗脱液比例的优化．准确称取4组相等的茶叶样品，同时添加质量浓度为0.05 mg/kg的氟环唑标准液，只改变洗脱液正己烷、丙酮的体积比，体积比分别为6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，计算回收率，确定洗脱液比例．

⑥固相萃取柱选择.为了使净化效果达到最佳，分别选用C18，NH2和Florlisil 3种固相萃取柱，氟环唑标准液质量浓度为0.05 mg/kg，其他条件不变，计算回收率，确定最佳萃取柱．

⑦方法的重复性实验．在选定的最佳实验条件下对加标水平为0.05 mg/kg的茶叶样品进行处理及测定，连续5天每天测一次，计算其精密度．

⑧方法的回收率实验．取3份等量的茶叶样品，选择3种不同质量浓度的氟环唑标准液进行加标，添加水平分别为0.02 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg，采用最佳的实验条件进行分析，连续测定5次，取平均值，计算回收率和变异系数．

⑨结果计算公式．氟环唑质量含量c1(ug/g)按下式计算

式中，c1为样品中氟环唑含量(μg/g)；c为仪器检测的质量浓度(mg/L)；V为最终定容体积(mL)；m为样品质量(g)．

2 结果与讨论

2.1 提取剂的选择

氟环唑在不同提取剂中的溶解度是不一样的，在满足实验要求的前提下，不同的提取剂对氟环唑的回收率有一定的影响．提取剂对氟环唑回收率的影响如图1所示.由图1可知，乙腈和丙酮作为提取剂，回收率较高，实验过程中发现丙酮萃取液中含有大量的色素，导致后续的净化过程存在一定的困难，故选择乙腈作为提取剂．

2.2 提取剂体积的选择

选定乙腈作为提取剂，改变乙腈的体积，考察乙腈体积对氟环唑回收率的影响， 结果如图2所示.由图2可知，乙腈体积为20 mL时回收率最高；乙腈体积小于20 mL时，提取的不够充分；乙腈体积大于20 mL时，导致后续浓缩过程的氟环唑的损失，故选择最优提取剂体积20 mL．

图1 提取剂对氟环唑回收率的影响 图2 提取剂体积对氟环唑回收率的影响

2.3 NaCl加入量的选择

在样品溶液中加入NaCl会降低待测物在水相中的溶解度、制约萃取剂在水中的溶解性，从而有利于对待测组分回收．NaCl质量对氟环唑回收率的影响如图3所示.由图3可知，在NaCl的用量逐渐增加时氟环唑的回收率先增加后降低，在NaCl的用量为0～0.8 g时，回收率呈线性增加，NaCl加到0.8 g时成为转折点，随着NaCl质量浓度增高导致萃取效果变差，回收率降低．因此选择0.8 g作为NaCl的最佳用量．

2.4 超声处理时间的选择

样品的前处理过程中，超声辅助萃取可以提高萃取效率．实验具体考察了不同的超声处理时间对氟环唑回收率的影响，结果如图4所示.由图4可知，超声处理时间由0 min到15 min时，萃取效果在提高，继续超声处理，其促进作用达到了饱和，可能是因为氟环唑见光易分解的特性，长时间暴露在日光中，有部分损失掉了，使得氟环唑的回收率开始下降，综合考虑超声时间为15 min时最佳．

图3 NaCl质量对氟环唑回收率的影响 图4 超声时间对氟环唑回收率的影响

2.5 洗脱液比例的优化

由于样品的基质较杂，合适的洗脱液可使目标物尽可能从柱中洗脱下来，同时减少杂质被洗脱下来，对比研究了不同体积比洗脱液的洗脱效果,结果如图5所示.由图5可知，氟环唑的回收率随着洗脱液体积比的减小先增高后降低，在体积比为7:3时回收率较高，可能是由于洗脱液的极性偏大或偏小，不利于目标物的洗脱净化，导致氟环唑的回收率较低．

2.6 固相萃取柱选择

样品中的基质成分复杂多样，必须经过净化处理，不同的萃取柱性能、效果不同，合适的萃取柱可降低检测器的杂峰干扰，提高回收率．为了最大限度地排除杂质离子的干扰，对比研究了不同种类的固相萃取柱的净化效果，结果如图6所示.由图6可知，Florlisil柱的净化效果最好．

图5 洗脱液比例对氟环唑回收率的影响 图6 萃取柱种类对氟环唑回收率的影响

2.7 标准曲线的绘制

图7 氟环唑标准曲线 图8 氟环唑标准溶液气相色谱图(1.275 μg/mL)

2.8 响应面分析优化氟环唑的提取条件

(1)响应面试验因素水平的选择.实验根据以上单因素实验结果，选超声时间、氯化钠用量和提取剂体积为主要考察因素，以氟环唑的回收率为指标，设计3因素3水平响应面试验，选用Design-Expert 8.0软件中Box-Behnken作为响应面模型．实验的因素及水平如表1所示．

表1 响应面试验

(2)响应面实验设计及结果分析.以A(超声时间)、B(NaCl用量)、C(提取剂体积)为自变量，氟环唑的回收率为Y(响应值)，以此进行17组分析试验，其中用以估算误差中心试验有5个．BBD的试验结果如表2所示.根据表2中试验的结果应用Design-Expert 8.0软件进行分析，3个自变量模型的方差分析结果如表3所示.由表3可知,模型的F=16.77，P=0.000 6<0.001，表明实验的二次模型是极显著的，在统计学上有意义．实验失拟项P=0.131 4>0.05，对模型有利，无失拟因素，数据中无异常点出现，因此可用于预测各因素与氟环唑回收率的关系．

由Design-Expert 8.0软件得出各个因素的效应图如图9、图10、图11所示．由图9、图10、图11可知，图形的表面有明显弯曲，可得各个因素对响应值Y是非线性的，A、B、C三个因素水平存在极值点．

(3)响应面回归模型的建立.结合Design-Expert软件计算，可得该响应面模型的回归方程如下：

R=-281.546 25+22.601 25A+205.528 12B+12.283 5C-3.275AB-2.7E-003AC-5.076 25BC-0.629 8A2-42.125B2-0.214 9C2

(4)各因素水平的优化．根据效应图绘制回归方程的3D响应面图，回归方程存在极值点．为了确证其最佳值，对方程取一阶偏导，整理可得：

22.601 25-3.275B-2.7E-003C-1.259 6A=0

205.528 12-3.275A-5.076 25C-48.25B=0

12.283 5-2.7E-003A-5.076 25B-0.425 8C=0

解方程组得A=13.02，B=0.75，C=19.65，代入响应面方程得到氟环唑的最大响应值是87.31．即在超声时间13 min，NaCl用量0.7 g，提取剂乙腈20 mL时，氟环唑的回收率高达87.31%．

表2 BBD的试验结果

表3 响应面试验的方差分析结果

P<0.05时，影响显著；P<0.01时，影响极显著，分别用*和**表示

图9 A和B对氟环唑回收率的影响 图10 A和C对氟环唑回收率的影响

图11 B和C对氟环唑回收率的影响

2.9 方法的重复性实验

准确称取茶叶样品，按上述方法进行测定，结果如表4所示．由表4可知，样品中氟环唑质量浓度的平均值是0.044 7 mg/kg，RSD为3.55%，方法重复性和精密度较好．

表4方法精密度实验

天数氟环唑/mg·kg-1平均值/mg·kg-1RSD/%10.043220.047130.04330.04473.55

2.10 方法的回收率实验

分别称取3份茶叶样品，在样品中分别加入0.02 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg 3种质量浓度的氟环唑标准液，以最佳条件进行实验处理，结果如表5所示.由表5可知，氟环唑在茶叶中的添加回收率范围为86.38%～92.06%，平均回收率为89.32%，且变异系数范围为3.06%～5.64%，可见方法的回收率较好．茶叶粉中氟环唑的添加回收色谱图(加标水平为0.127 5 mg/kg)如图12所示．

表5 方法的回收率实验

图12 氟环唑在茶叶中的添加回收色谱图

3 结论

SPE-GC测定茶叶中的氟环唑残留量的实验中，样品净化步骤采用Florlisil柱，应用Design-Expert 8.0优化样品预处理方法，得到最佳条件下回收率为87.31%，加标回收率在86.38%～92.06%之间，重复性实验RSD为3.55%，最低检出限为0.007 μg/mL．实验操作简单、快速、稳定，方法的精密度、重现性、灵敏度、回收率、线性关系良好，可用于大量样品的检测．