新型多孔有机骨架材料在地表水中21种糖皮质激素高通量筛查中的应用

褚莹倩 ,陈 溪 ,崔 晗 ,吴 慈 ,林天野 ,贾钧越

(1.大连海关技术中心,大连 116000;2.乔治城大学 隆巴迪综合癌症中心,华盛顿20057)

糖皮质激素是一类甾体激素,具有抗过敏和免疫抑制作用[1],被广泛运用于临床医学和兽医防治,糖皮质激素的大量使用使之易随生活污水、医疗废水、养殖废水等多种途径进入环境[2-6]。环境中的糖皮质激素通常处于ng·L－1的浓度水平,表现出内分泌干扰特性,易对水生生态环境构成潜在威胁,甚至可能危害到人们的饮水安全[7-10]。然而,目前对环境水体中糖皮质激素的分布特点和浓度水平等方面的研究还非常有限,其中一个重要原因就是缺乏准确、快速、高效识别和测定环境水体中该类物质的分析方法[11]。

固相萃取技术在水质检测的样品前处理环节发挥了重要作用,主要包括柱固相萃取、分散固相萃取、纤维固相萃取等多种方式。固相萃取技术通常具有富集效率高、抗干扰能力强、操作简便的优点,其核心在于固相萃取填料的性能[12],因此新型高性能、高选择性的填料的制备和应用一直是近年来的研究热点。

随着材料技术的快速发展,各种新型微米、纳米级材料被广泛应用于固相萃取技术,如碳纳米材料、气凝胶材料、分子印迹材料、有机骨架材料等。其中,多孔有机骨架材料(POFs)就是一类由轻元素(C、H、O、N、B)通过共价键连接刚性构建单元形成的有序的多孔材料,具有结构新颖、孔道结构和表面官能团可控、比表面积高的特点,且表现出良好的机械强度、优异的热稳定性和化学稳定性,广泛应用于气体存储、光电器件、药物释放、化学分析等领域[13-20]。

本工作利用自主合成的新型POFs 制备了POFs固相萃取柱,旨在发展一种新的地表水中21种糖皮质激素的固相萃取前处理方法,再采用高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-Q/Orbitrap MS)技术对地表水中21 种糖皮质激素进行高通量筛查检测,以期建立地表水中糖皮质激素的有效可行、环境友好的前处理手段,进而为水质检测提供新的技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex Ulti Mate 3000 型高效液相色谱仪;Thermo Q Exactive Plus型四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪和Xcalibur工作站;N-EVAP 112型氮吹仪;613-UF-70 型纯水机;MS3 型数显涡旋混合仪;3K15型台式冷冻离心机;X205DU 型电子天平(精确至0.01 mg);KH-500DE 型超声波提取仪;57265型固相萃取装置;3 mL 固相萃取柱,柱管带筛板;0.22μm 有机滤膜;100 mL 大体积储液管,连接转换头。

单标准储备溶液:100 mg·L－1,称取适量的糖皮质激素标准品(泼尼松、可的松、泼尼松龙、氢化可的松、曲安西龙双乙酸酯、氟米松、乙酸氟氢可的松、乙酸泼尼松、倍氯米松、甲基泼尼松龙、乙酸可的松、泼尼松龙乙酸酯、乙酸氢化可的松、氟米龙、氟氢缩松、地夫可特、曲安奈德、甲基泼尼松龙乙酸酯、氟米龙乙酸酯、丁酸氢化可的松、布地奈德),用甲醇稀释,配制成质量浓度为100 mg·L－1单标准储备溶液。

混合标准溶液:1.00 mg·L－1,移取适量的单标准储备溶液,用甲醇稀释,配制成质量浓度为1.00 mg·L－1的混合标准溶液,于－18 ℃冷冻保存。

混合标准溶液系列:取适量的混合标准溶液,用0.5%(体积分数,下同)甲醇溶液逐级稀释,配制成质量浓度为20,25,50,80,100μg·L－1的混合标准溶液系列。

糖皮质激素标准品的纯度均大于98.3%,其他信息见表1;乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯;氨水、丙酮、盐酸、乙二胺四乙酸二钠、1,3,5-三苯基苯、甲苯、二甲氧基甲烷、三氯化铁和1,2-二氯乙烷均为分析纯;试验用水为蒸馏水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Accucore RP-MS色谱柱(100 mm×2.1 mm,2.6μm);流量0.3 mL·min－1;进样量10μL;柱温40 ℃;流动相A 为0.1%(体积分数)甲酸溶液,B为甲醇;梯度洗脱程序:0～2.0 min 时,A 为95%;2.0～7.0 min 时,A 由95% 降至70%;7.0～11.0 min时,A 由70%降至10%,保 持2.0 min;13.0～13.1 min 时,A 由10%跳转至95%,保 持2.9 min。

1.2.2 质谱条件

加热电喷雾离子源,正离子模式,离子源温度350 ℃;离子传输管温度320 ℃;鞘气和辅助气均为氮气(纯度为99.99%),流量分别为12 L·min－1和3 L·min－1;喷雾电压3.2 k V;透镜电压50 V;一级全扫描/二级质谱(Full MS/dd-MS2)扫描模式。Full MS模式参数:分辨率7×104,自动增益控制1×106,最大驻留时间100 ms,扫描范围 质荷比(m/z)100～1 000,强度阈值1.6×105。dd-MS2模式参数:分辨率17 500,自动增益控制2×105,最大驻留时间50 ms。归一化碰撞能量30,45,60 e V。其他质谱参数见表1。

表1 21种糖皮质激素的信息和质谱参数Tab.1 Information and MS parameters of 21 glucocorticoids

表1 (续)

1.3 试验方法

1.3.1 POFs的制备

于25 mL圆底烧瓶中,分别加入1.20 g 1,3,5-三苯基苯、0.92 g甲苯和3.04 g二甲氧基甲烷,以6.5 g三氯化铁为聚合反应的催化剂,以20 mL 1,2-二氯乙烷为溶剂,整个体系在80 ℃加热24 h,使1,3,5-三苯基苯、甲苯和二甲氧基甲烷均匀聚合。待反应完成之后,以甲醇为溶剂索氏提取粗产物24 h,去除未充分反应的单体和催化剂,将洗涤后的沉淀于80 ℃烘干24 h,用研钵研磨,过0.15 mm筛,收集得到含有苯基官能团的新型POFs,如图1所示。

图1 新型POFs的合成Fig.1 Synthesis of novel POFs

1.3.2 POFs固相萃取柱的填装

选用3 mL固相萃取空柱管,将空柱管分别用丙酮、超纯水彻底清洗干净,去除油污。将下筛板放入柱管底部固定,加入新型POFs 20 mg作为填料,放入上筛板,压实填料,形成POFs固相萃取柱,分别用甲醇和乙腈各30 mL 淋洗POFs固相萃取柱,去除填装过程引入的杂质,最后用15 mL 水淋洗POFs固相萃取柱,晾干以备用,如图2所示。

图2 POFs固相萃取柱填装示意图Fig.2 Schematic of the solid phase extraction column filled with POFs

1.3.3 样品前处理

水样经过滤预处理后,取50 mL 水样,加入25 mg乙二胺四乙酸二钠,测定水样的酸度,根据需要用盐酸或氨水调节水样酸度至中性。用甲醇和水各6 mL对新型POFs固相萃取柱进行活化,连接大体积储液管,取待净化水样过柱,控制流量为1～2滴/s,待水样过柱后,先用5 mL 水淋洗POFs固相萃取柱并吹干,再用6 mL体积比为1∶1的甲醇-乙腈混合溶液洗脱POFs固相萃取柱并收集洗脱液,于40 ℃氮吹至近干。残渣用1 mL 0.5%甲醇溶液重新溶解,充分混匀后过0.22μm 有机滤膜,按照仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱数据库的建立

参考文献[20]方法,优化了色谱条件,在色谱条件下,通过高分辨质谱的Full MS/dd-MS2模式,设定扫描范围m/z100～1 000,利用Full MS模式确定目标物的精确质量数(分子离子峰的m/z)和保留时间。当母离子强度达到设定的强度阈值(1.6×105)时,自动进行dd-MS2模式扫描,得到对应母离子精确质量数的二级离子全扫描质谱信息,选择至少2个具有代表性的二级碎片离子作为定性离子。将目标化合物的名称、分子式、CAS号、保留时间、扫描模式、精确质量数和二级特征碎片离子等相关信息输入TraceFinder软件,建立高分辨质谱筛查数据库,设置筛查条件为:理论精确质量数与实际测量质量数的误差绝对值控制在5×10－6内,响应强度阈值为1×104,匹配最少碎片个数为1,相关信息如表1所示。

2.2 POFs固相萃取柱填料量的选择

按照试验方法,制作填料量分别为10,15,20,25 mg的新型POFs固相萃取柱,按照固相萃取步骤对21种糖皮质激素加标量为1.0μg·L－1的水样进行回收试验,结果如图3所示。

由图3可知:填料量为10 mg的POFs固相萃取柱对不同化合物的吸附性能差别较大,回收率为41.2%～89.3%;相比而言,填料量为15,20,25 mg的POFs固相萃取柱对不同化合物的吸附性能差别不大,且回收率均较高。试验最终选取填料量为20 mg的POFs固相萃取柱用于后续的试验。

图3 21种糖皮质激素在不同填料量的POFs固相萃取柱上的回收率Fig.3 Recovery of 21 glucocorticoids on the solid phase extraction columns filled with different amounts of POFs

2.3 POFs固相萃取柱的重复性测试

POFs具有良好的机械强度、优异的热稳定性和化学稳定性,使得POFs固相萃取柱具有可再生性,进而可重复使用。以加标量1.0μg·L－1的6种糖皮质激素(可的松、氟氢缩松、氟米松、曲安奈德、倍氯米松和丁酸氢化可的松)的水样为研究对象,使用20 mg POFs固相萃取柱对水样进行回收试验。使用后的POFs固相萃取柱分别用30 mL 甲醇和30 mL乙腈淋洗,以去除残留在POFs中的干扰物,使POFs 恢复原有的功能,再用15 mL 水淋洗POFs固相萃取柱,吹干备用。使用同一根POFs固相萃取柱重复5 次上述回收试验,结果如图4所示。

由图4可知,重复使用的POFs固相萃取柱对目标物仍然具有较好的吸附性能,回收率均能够达到50%～120%的要求,表明POFs固相萃取柱对糖皮质激素的吸附性能稳定,并且至少可以重复使用5次。

图4 POFs固相萃取柱的重复使用次数-目标物回收率的关系Fig.4 Relationship between reuse times of POFs solid phase extraction column and recovery of target

2.4 标准曲线和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以待测物的分子离子峰面积对其质量浓度进行线性回归,通过仪器自带的TraceFinder软件获得各目标物的标准曲线。结果显示,目标物标准曲线的线性范围为20～100μg·L－1,线性回归方程和相关系数见表2。

表2 线性参数Tab.2 Linearity parameters

表2 (续)

在高分辨质谱的分析中,提取的分子离子峰响应信号很强,噪声相对较低,采用传统的信噪比(S/N)方法不适用于测定下限的计算[21]。因此,对空白水样进行加标回收试验,以满足回收率在50%～120%内的最低浓度水平为方法的测定下限,得到21种糖皮质激素的测定下限为20μg·L－1。

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法对空白水样进行0.4,1.0,2.0μg·L－1等3个浓度水平(富集后的加标浓度水平分别为20,50,100μg·L－1)的加标回收试验,每个浓度水平制备6个平行水样,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.6 样品分析和方法对比

以大连地区6个水库水样(水库1～6)为研究对象,分别采集1 L水样,在冷藏条件下于棕色磨口玻璃瓶保存,使用20 mg POFs固相萃取柱,按照试验方法富集并测定水样中21种糖皮质激素的含量,结果见表4。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of the samples μg·L-1

结果表明:6个水库水样中均有不同种类糖皮质激素检出,检出总量为2.68～11.64μg·L－1(富集后的含量在线性范围内),其中乙酸泼尼松、乙酸可的松、曲安西龙双乙酸酯在6个水库中均有检出,为检出频率最高的糖皮质激素。前期研究中本课题组采用Cleanert PEP-2固相萃取柱(60 mg/3 mL)对相同水库水样进行样品前处理,经过筛查检测得到水样中激素类化合物的检出总量为1.79～9.33μg·L－1[22],不同前处理方法对相同水库水样分析所得结果在同一个数量级水平,表明本试验建立的分析方法有效且可行。比较两种不同固相萃取柱对激素类化合物的富集效率,发现二者对水样中糖皮质激素表现出相似的富集浓缩效果,表明自制的新型POFs固相萃取柱对水样中糖皮质激素的富集是可行且有效的,满足地表水中糖皮质激素的测定要求。

本工作利用自主合成的新型POFs 制备了POFs固相萃取柱,并优化了其填料量,采用HPLCQ/Orbitrap MS技术对地表水中21种糖皮质激素进行高通量筛查检测,与Cleanert PEP-2固相萃取柱对水样中的糖皮质激素的富集具有相似效果,表明该方法可行、准确且高效,满足地表水中糖皮质激素的分析要求。通过对新型POFs固相萃取柱的吸附性能的重复性试验,发现该固相萃取柱可以多次重复使用,可减少很多一次性试验用品的消耗,避免环境污染和资源浪费。