碳青霉烯酶在亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌中的作用

侯盼飞，祝丽晶，潘 艳

(涟水县人民医院 检验科，江苏 涟水223400)

鲍曼不动杆菌为革兰氏阴性杆菌，广泛定植于人体皮肤、口腔、呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道等部位，可引起医院内获得性肺炎、脑膜炎、败血症、中枢神经系统感染、泌尿系统感染及伤口感染等。从2005年到2014年其检出率、耐药率急剧上升[1]，尤其对碳青霉烯类耐药已引起国内外学者的广泛关注。本研究对亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌(Imipenem resistant Acinetobacter baumannii，IRAB)的耐药性及碳青霉烯酶的携带情况作一探讨。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株 临床菌株：选取2016年1月12月我院临床分离的非重复鲍曼不动杆菌100株，其中IRAB和亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌(Imipenem sensitive Acinetobacter baumannii，ISAB)各50株。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922购自江苏省临检中心。

1.1.2试剂 抗菌药物粉剂购自上海科佳药检器材公司，血琼脂培养基购自安图生物工程股份有限公司，PCR反应试剂盒购自上海生工生物科技有限公司。

1.1.3仪器 Vitek2 compact细菌鉴定仪购自法国生物梅里埃公司，PCR扩增仪购自美国ABI公司，凝胶成像仪、电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1药敏试验 采用琼脂稀释法检测100株鲍曼不动杆菌对临床常用16种抗菌药物的耐药性。具体方法及结果解释标准参照CLSI 2014年版[2]。

1.2.2改良Hodge试验 将大肠埃希菌ATCC25922菌悬液均匀涂布于M-H琼脂平板上，干燥后，在平板上中心贴10μg亚胺培南纸片，用1 μl接种环挑取3-5个待测菌株并在平板上接种，接种时从平板中心纸片边缘向平板边缘划线，长度至少20-25 mm,35℃培养过夜，观察生长状况。

1.2.3PCR扩增 采用煮沸法提取基因组DNA。引物序列如表1所示，由上海英潍捷基公司合成。PCR反应采用25 μl体系，反应条件：94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，54-60℃(具体退火温度见表1) 45 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察特异性扩增条带。

表1 碳青霉烯酶基因引物序列及退火温度

1.2.4序列测定 选取部分扩增产物送上海英潍捷基公司进行测序。结果用基因库中的Blast程序进行同源性分析。

1.2.5统计分析 采用SAS8.0统计学软件对资料进行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1药敏结果所检测100株细菌对替加环素、多粘菌素B均敏感，IRAB除对头孢哌酮/舒巴坦(32%)和米诺环素(30%)耐药率低外，对其他抗菌药物耐药率均较高，而ISAB除对氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢西丁耐药外，对多数抗生素均较敏感。IRAB和ISAB耐药性比较见表2。

2.2改良Hodge试验结果50株IRAB中有41株出现矢状生长现象，即产碳青霉烯酶，阳性率82%，50株ISAB均为阴性。

2.3基因检测结果PCR扩增显示IRAB中SHV、PER、TEM、OXA-23阳性率分别为70%、56%、34%和90%，与ISAB相比差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。将 PCR 扩增产物纯化后进行测序，结果经Blast 比对，SHV、PER、TEM和OXA-23与 Genbank相关基因同源性分别为99%、98%、97%和100%。所检测菌株KPC、NDM、IMP、VIM、SIM和OX-24基因均阴性。

表2 亚胺培南耐药与敏感鲍曼不动杆菌耐药性比较

IRAB:imipenem resistant Acinetobacter Baumannii;ISAB:imipenem sensitive Acinetobacter Baumannii.

表3 亚胺培南耐药与敏感鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因检测结果

IRAB:imipenem resistant Acinetobacter Baumannii;ISAB:imipenem sensitive Acinetobacter Baumannii

3 讨论

鲍曼不动杆菌是引起医院感染的重要条件致病菌，高检出率、高耐药率引起国内外学者广泛关注。2012年由国内知名专家发起和起草的《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》，将鲍曼不动杆菌列为我国目前最重要的“超级细菌”[3]。2017年世界卫生组织公布全球抗菌药物耐药菌优先性列表将耐碳青霉烯类的鲍曼不动杆菌列为优先1级(危急)。鲍曼不动杆菌一旦对碳青霉烯类耐药往往会呈现多重耐药甚至泛耐药。

2016年Chinet细菌耐药性监测网[4]对国内主要地区30所教学医院病原菌耐药性监测显示，不动杆菌属(鲍曼不动杆菌占90.6%)对多数药物耐药率均在50%以上，对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别高达68.6%和71.4%。本研究显示IRAB除对多粘菌素B、替加环素均敏感，对头孢哌酮/舒巴坦(32%)、米诺环素(30%)耐药率较低外，对其它药物耐药率均超过70%，与Chinet及其它学者的报道基本一致[4-6]。IRAB治疗非常棘手，一种方法是选择更高级的抗生素，如替加环素、多粘菌素，另一种方法是联合用药，如选用头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦或碳青霉烯类联合氨基糖苷类或喹诺酮类药物[3,7]。

产碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的重要原因[8]。CLSI[2]要求肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶初筛试验阳性和对一种或多种三代头孢菌素(包括头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟和头孢曲松)耐药，应使用改良Hodge试验进行碳青霉烯酶确证试验。但国内外对改良Hodge试验检测鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶研究较少，Lee等[9]对28株不动杆菌进行检测发现改良Hodge试验是检测碳青霉烯酶非常有效的方法。本研究显示，IRAB中碳青霉烯酶表型阳性率82%，而ISAB全阴性，说明产碳青霉烯酶是鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的重要原因。

常见的碳青霉烯酶主要包括[10]：A 类超广谱β-内酰胺酶，如SHV、TEM、KPC、RER、CTX等，可引起青霉素类、碳青霉烯类等耐药，可被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦抑制；B 类酶，又称为金属β-内酰胺酶，对β-内酰胺类抗生素具有强大的水解能力，包括IMP、VIM、SIM、NDM；D类苯唑西林酶(OXA)，主要包括OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58等亚型，其中OXA-23是鲍曼不动杆菌中报道最多的。本研究对鲍曼不动杆菌10种常见碳青霉烯酶基因检测发现SHV、PER、TEM、OXA-23阳性率分别为70%、56%、34%和90%，与ISAB相比差异有统计学意义；未检出KPC、NDM、IMP、VIM、SIM和OX-24，与明德松等[11]的报道基本一致。

鲍曼不动杆菌耐药机制复杂多样，有报道TEM常联合孔道蛋白缺失或AdeABC外排泵存在引起碳青霉烯类耐药[12]，OXA-23介导的耐药常与插入序列ISAbal等[13]相关。本研究也显示ISAB中OXA-23阳性率虽与IRAB存在显著差异，但高达42%，显著高于潘红超(2.9%)等[14]的报道，因此推测可能还存在其他耐药机制，不同耐药机制间存在相互作用关系，这有待进一步研究。