黄芪多糖对5-氟尿嘧啶诱导心肌损伤的干预作用研究

吴东垣，刘 炜，李双斌，崔 燕，祝金明

(1.吉林市中心医院，吉林 吉林132011；2.吉林大学第二医院；3.吉林大学中日联谊医院)

5-氟尿嘧啶(5-FU)被广泛用于治疗乳腺癌、妇科和胃肠癌症[1]，可以抑制胸苷的活性，在细胞周期的S期抑制DNA的合成[1，2]，也能抑制RNA合成和加工[3]。5-FU的副作用主要包括白细胞减少、口腔炎、心脏毒性和消化系统症状[4,5]。5-FU的心脏毒性给患者带来严重威胁[6]。有研究表明，氧化应激产生反应性氧化物(ROS)是化疗药物产生心脏毒性的主要机制[7，8]，这将导致心肌细胞肥大、凋亡、心室重构等，进一步导致心力衰竭[9]。黄芪多糖(APS)是黄芪的主要成分，在心肌缺血的治疗中有显著效果[10]，可改善冠脉血流量，降低过氧化脂质含量，增加超氧化物歧化酶(SOD)活性，从而保护心脏[11-13]。然而，APS是否可以改善5-FU诱导的心脏毒性仍然未知。本研究旨在探讨APS是否可以缓解氧化应激，抑制5-FU诱导的心肌损伤。

1 材料与方法

1.1 心肌细胞培养

取出大鼠心脏后，用Ⅱ型胶原酶(Worthington)溶液消化。消化2 h后，收集心肌细胞。

1.2 动物实验

8周龄雄性SD大鼠，随机分为3组，灌胃饲养7天：第1组：生理盐水组；第2组：5-FU(1 mg/kg体重)；第3组：5-FU+ APS(1.5 g/kg体重)。在此之后，切除心脏并提取蛋白质。

1.3 细胞增殖测定

心肌细胞在1%明胶包被的96孔组织培养板中以5000个细胞/孔的密度培养。 24 h后，5-FU溶解在DMSO中，以1 nM、10 nM、100 nM和1 mM的最终浓度加入培养基中。DMSO加入作为阴性对照。MTT试剂以0.5 mg/ml的终浓度加入每个孔，在37℃温育5 h。然后，除去培养基，每孔加入100 μl DMSO溶解结晶。使用微板读数器测定每孔570 nm下的吸光度。此外，将细胞用100 nM 5-FU预培育12、24、48和72 h，并以相同的方法测定细胞生存力。每个实验独立进行至少3次。

1.4 活性氧检测

细胞在六孔细胞培养板上培养，24 h后，以1 nM、10 nM、100 nM和1 mM终浓度的5-FU处理细胞。48 h后，收集心肌细胞，离心，在PBS中洗涤3次(5 min/次)。然后将载玻片用5 μM DHE(Vigorous Biotechnology Beijing Co.,Ltd)在无血清的DMEM F-12培养基中37℃黑暗处理30 min。将细胞在4%多聚甲醛中室温下固定30 min。将载玻片用冷PBS洗涤3次并置于显微镜下。免疫荧光图像通过荧光显微镜捕获。用流式细胞仪(BD公司)分析相对荧光强度，检测心肌细胞内ROS含量。

1.5 Western blot分析

用细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology公司)裂解细胞并收集总裂解物，使用BCA蛋白质(Millipore，Billerica，MA，USA)测定蛋白浓度。等量蛋白用12%的SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore，Billerica，MA，USA)。将膜用5%(重量/体积)脱脂奶粉在室温下孵育2 h。该膜与一抗兔抗人eNOS和Bcl-2、Bax和GAPDH(细胞信号)一起温育。抗体根据制造商的说明，在5%牛血清白蛋白稀释。然后加入辣根过氧化物酶缀合的二抗，并使用化学发光仪(ECL，Amersham Biosciences公司)通过放射自显影检测所产生的信号。GAPDH作为内参。

1.6 酶活性测定

组织匀浆以2 000 rpm/min离心10 min。根据制造商的说明,使用检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，南京，中国)测定总蛋白、SOD、过氧化氢酶(CAT)和MDA的含量。

1.7 统计学方法

数据被表示为平均值±标准误(mean±SEM)表示。采用SPSS10.0软件进行统计评估。统计比较采用单因素方差分析(ANOVA)进行，并采用Dunn’s方法以鉴别组间差异。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5-FU显著增强心肌细胞ROS的产生

5-FU预处理显著增强心肌ROS的产生，并呈现剂量依赖性(图1)。

图1 5-FU显著增强原代心肌细胞ROS的产生，并呈现剂量依赖性

2.2 5-FU降低原代心肌细胞活力，呈剂量和时间依赖性

MTT法用来研究5-FU对细胞活力的影响。如图2A，5-FU孵育的心肌细胞在100 nM和1 mM浓度时，细胞活力显著降低。同时，用100 nM 5-FU处理的心肌细胞，细胞活力在48 h和72 h分别下降了34.5%和42.3%(图2B)。

(A)5-FU 100 nM和1 mM显著降降低心肌细胞活力。(B)心肌细胞用100 nM 5-FU处理后48 h和72 h，细胞活力分别减少34.5%和42.3%。数据代表平均值±SEM，n=3独立试验。*与对照组相比，P<0.05，**与对照组相比，P<0.01。

图25-FU降低心肌细胞活力，呈现剂量和时间依赖性。

2.3 5-FU在体内诱导心脏毒性和细胞凋亡

在体外研究中发现与5-FU显著增强半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活化(图3A)。同时，凋亡抑制基因Bcl-2蛋白水平显著降低，而凋亡基因Bax蛋白

水平显著增强(图3A)。在心肌细胞用100 nM 5-FU处理时，我们还检测了SOD和丙二醛(MDA)含量。该数据表明，5-FU显著降低SOD的含量而提高MDA水平，这表明5-FU具有心脏毒性作用(图3B和3C)。

(A)5-FU显著增强caspase 3活性。(B)5-FU降低超氧化物歧化酶(SOD)的含量。(C)5-FU增强MDA的水平。数据代表平均值±SEM，n= 3独立试验。*与对照组相比，P<0.05，**与对照相比，P<0.01。

图35-FU体内诱导心脏毒性和细胞凋亡

2.4 黄芪多糖通过调节活性氧的产生抑制5-FU诱发的心肌损伤

APS预孵育可以显著逆转SOD下降，降低MDA含量(图4A)。 Western blot分析表明，APS治疗可以降低5-FU诱导的caspase3的激活和Bax蛋白在体内的表达水平。对比单独5-FU处理组，APS治疗可以上调Bcl2蛋白的表达水平(图4B)。

3 讨论

心脏损伤是化疗药物的严重副作用之一，显著限制了其临床应用[14]。明确化疗药物心脏毒性的发生机制，可以降低化疗药物对正常组织的不良影响，改善肿瘤治疗效果，具有重要意义。

5-FU已经广泛应用于癌症治疗[15，16]。据报道，心脏毒性的发生率极高，范围从20%至100%[17，18]。本研究中，对5-FU产生心脏毒性的具体机制进行了探讨，从而为制定预防心脏毒性的策略提供了有效参考。本研究中，我们使用不同浓度的5-FU处理心肌细胞，发现它可以显著提高ROS水平。此外，MTT结果显示，5-FU处理可以降低心肌细胞活力并呈现剂量和时间依赖性，而且5-FU明显增强caspase 3活性。更重要的是5-FU可以降低SOD含量并增加MDA含量。这些体外实验表明，5-FU能诱导大鼠心肌细胞损伤。

(A)APS预孵育显著提高SOD的水平，降低MDA含量。(B)APS降低5-FU诱导的caspase3激活和Bax的表达。数据代表平均值±SEM，n=3独立试验。*与对照组相比，P<0.05，**与对照相比，P<0.01。

图4黄芪多糖APS可通过调节ROS生成，改善5-FU引起的心脏损伤

黄芪多糖是具有悠久应用历史的传统中药，可增强机体免疫力，降低癌症细胞的生长并能减轻炎症反应[19]。已有研究表明，APS是一种有效的保护性药剂，可以改善心脏损伤，例如可以抑制心肌肥大、改善心力衰竭[20]。在人类和动物心脏衰竭模型中，心肌氧化应激均可导致心室明显扩张[21，22]。ROS通常是由心肌细胞在化疗药物作用下释放[23]。我们确定了ROS由5-FU以剂量依赖性方式诱导产生。

在本研究中，我们发现，黄芪多糖主要通过缓解氧化应激而抑制5-FU诱导的心肌细胞凋亡。因此，我们的研究为防治5-FU引起的心肌损伤提供了新的方法。