过表达GINS2基因对NB4细胞增殖的影响

高艳军，邢志伟，杜月菊，徐美丽，李 刚，王世博

(1.河北省胸科医院 检验科，河北 石家庄050041;2.河北医科大学第二医院 感染控制处，河北 石家庄050000)

当前白血病的治疗主要包括化疗，骨髓移植和一些靶向治疗，而化疗的毒副作用强，骨髓移植配型成功的几率比较低，故靶向治疗展现出巨大的潜能。近年来一些靶点突变体的发现对于白血病的病理机制研究提供新了的视角，同时也促进了靶向治疗的发展。美国首先应用DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂靶向治疗肿瘤[1]。

染色体DNA复制是一个高度调节的过程，涉及到大量的必需和非必需的蛋白因子，有效的DNA解螺旋是基因复制必要的先决条件，在真核生物中，MCM(微型染色体维持)蛋白复合体，是一种复制解螺旋酶，包括6个亚基(MCM2-MCM7)，但是MCM本身发挥极微弱的解旋功能，需要两个辅助因子GINS家族成员和Cdc45辅助完成[2-5]。GINS2也被称为PSF2，是GINS家族成员之一。GINS家族成员还包括GINS1，GINS3和GINS4，它们是真核生物复制叉的重要组成部分，在复制起始阶段发挥重要作用[6-9]。临床证据显示GINS2作为致癌基因可以出现在不同的恶性肿瘤中[10]。本文以GINS2作为靶基因，通过腺病毒载体感染白血病细胞NB4 细胞(人急性早幼粒白血病细胞)，观察过表达GINS2基因对NB4 细胞增殖的影响，为白血病基因诊疗靶点筛选奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料脂质体Lipofectamine 2000 购于美国的Invitrogen 公司；RNA 提取试剂Trizol购于日本的Takara 公司；鼠抗β-actine多克隆抗体，兔抗GINS2 多克隆抗体购于美国的Abcam 公司；HRP 标记的山羊抗兔IgG 和山羊抗小鼠IgG 购于北京的中杉金桥生物技术公司；优质胎牛血清购于杭州的四季青生物制品公司；RPMI-1640培养基购于Hyclone公司；MTT(噻唑蓝试剂)购于Sigma公司；人胚肾293和K562细胞购自上海生命科学院细胞库；Ad-GINS2腺病毒和空载由河北省胸科医院检验科保存。

1.2PCR检测NB4细胞GINS2基因的转录水平将NB4 细胞接种于75 ml的培养瓶内，培养24 h，Ad-GINS2感染NB4 细胞，48 h后提取细胞RNA,逆转录，采用GINS2 上下游引物进行PCR 反应，上游引物：5’-CGCGGATCCACCACCATGGACGCTGCC GA-3’，下游引物：5’-CCC AAGCTTCTAGAAGTCCTGAGACTGAGTAC-3’,扩增产物长度为558 bp。 PCR 反应条件如下：预变性 95℃，50 s；58℃，35 s；72℃，5 min；共35 个循环，72℃ 10 min。本文选GAPDH为内参，上游引物:5’-GCTGAGTATGTCGTGGAG-3’,下游引物：5’-TCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’,扩增产物长度为286 bp。PCR 反应条件如下：预变性 95℃，50s；60℃，35 s；72℃，5 min；共30 个循环，72℃ 10 min。空载病毒感染NB4细胞作为空载组，以未添加病毒的细胞作为未处理组。1.5%琼脂糖凝胶电泳并成像。上述实验重复3次。

1.3WesternBlot检测NB4细胞中GINS2蛋白水平将NB4 细胞接种于75 ml的培养瓶内，培养24 h，Ad-GINS2感染感染NB4 细胞，72 h后提取细胞蛋白，BCA方法定量 。每孔上样50 μg蛋白样品进行10%SDS-PAGE电泳分离后，湿转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，分别加入一抗(1∶600兔抗GINS2多抗；1∶500鼠抗β-actin多抗)，37 ℃孵育3 h，TBST洗膜3次。分别加入IgG/HRP标记的羊抗兔二抗(1∶1000)和IgG/HRP标记的羊抗鼠二抗(1∶1000)室温孵育1 h， TBST洗膜3次，经化学发光显色。以β-actin作对照，上述实验重复3次。空载病毒感染NB4细胞作为空载组，以未添加病毒的细胞作为未处理组。

1.4MTT法检测Ad-GINS2感染NB4细胞后的生长情况选对数期生长的NB4 均匀接种在96 孔板中，每孔接种量为1×104个，每孔200 μl,实验分组为：未处理组，空载组，感染组。每孔设5个复孔，分别在感染24、48、72 和96 h后，毎孔加入100 μl MTT溶液，培养4 h 后弃掉上清液，毎孔加入200 μl DMSO，室温摇床振荡10 min，酶标仪492 nm波长处测定。上述实验重复3次。细胞活力(%)=处理组OD值/空白对照组OD值×100%。

2 结果

2.1Ad-GINS2感染NB4细胞的荧光表达情况Ad-GINS2 感染NB4细胞，感染72 h后，观察红色荧光表达情况(图1)。

A、B感染72 h后红色荧光表达情况

2.2NB4细胞GINS2基因的转录水平通过RT-PCR检测GINS2 基因的表达情况。Ad-GINS2感染组与空载组和未处理组相比，感染组GINS2 表达显著升高，且差异有统计学意义(t值为4.726和9.865，P均<0.05,图2)，提示重组腺病毒成功感染NB4细胞并过表达目的基因。

1.空载组；2.Ad-GINS2感染组；3.未处理组；M：Marker DL2000

2.3NB4细胞中GINS2蛋白表达水平将NB4细胞接种于75 ml的培养瓶中，病毒感染72 h后，收获细胞并提取蛋白，免疫印迹法检测GINS2 蛋白的表达情况。Ad-GINS2感染组与空载组和未处理组相比，感染组GINS2 表达水平明显上调，且差异有统计学意义(t值为17.88和3.53，P均<0.05,图3)，提示重组腺病毒Ad-GINS2成功感染NB4 细胞并且过表达目的蛋白。

1.空载组；2.Ad-GINS2感染组；3.未处理组

2.4GINS2基因过表达对NB4细胞增殖的影响MTT分析结果显示，Ad-GINS2感染组与空载组和未处理组相比，第1 d(t值为3.455和2.234，P均>0.05)和第2 d(t值为0.417和1.383，P均>0.05)无明显变化，差别无统计学意义，第3 d(t值为15.15和11.84，P均<0.05)和第4 d(t值为8.476和9.896，P均<0.05)。结果显示重组腺病毒Ad-GINS2能明显促进细胞增殖(图4)。

*P<0.05与空载组和未处理组比较

3 讨论

急性髓细胞白血病是一类恶性克隆性疾病，往往预后不良，以多基因水平、多细胞水平、分子水平等多步骤发生异常为主要特征，从而导致不同种类的白血病治疗方案的差异，随着测序技术的发展，一些突变基因的发现，为进一步完善白血病靶向治疗提供了新的视角[11-15]。

在前期实验中我们应用酵母双杂交系统在白血病细胞 cDNA 文库中对与 PML-C相互作用的蛋白进行了筛选,其中首次发现GINS2与 PML-C在酵母细胞内存在相互作用且通过免疫共沉淀技术得到一步验证，并且通过沉默GINS2 基因可导致细胞凋亡增加，抑制细胞生长和活性。参阅文献发现，GINS2在乳腺癌，黑色素瘤等恶性肿瘤细胞中表达升高，并促进了其发生和发展[16-18]，但其在急性髓细胞白血病细胞中的功能少有报道。为了进一步研究 GINS2 表达与肿瘤发生的关系。本实验通过构建重组腺病毒载体技术过表达GINS2基因，观察GINS2基因对白血病细胞NB4细胞体外增殖能力的影响，细胞活力实验结果显示GINS2基因过表达之后能进一步促进细胞增殖。但具体的机制有待进一步研究。

综上所述，在白血病NB4细胞中，GINS2蛋白在白血病细胞的生长发育中发挥重要的作用，为白血病的靶向治疗筛选新的靶点提供新的思路。