蒙药乌力地格抑制胶质瘤裸鼠移植瘤生长的研究

海岳东，白 爽,王育民,图门乌力吉,赵 盛,王睿君

(内蒙古医科大学附属医院，内蒙古 呼和浩特010050)

胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，发病率和死亡率高，严重危害人体健康[1]。尽管在过去的几十年中治疗方法显着的改善，但胶质瘤患者的预后和存活仍然较差[2]，因此，迫切需要找到有效措施来解决上述问题。研究显示胶质瘤的侵袭性生长极大地限制了治疗效果和预后[3]，因此，寻找抑制胶质瘤生长的新治疗方法对于改善预后至关重要[4]。蒙药乌力地格又称为梅花草，乌力地格气味干枯，具有清热解毒以及破痞的功效，在现代蒙医临床应用中乌力地格是治疗肿瘤的常用药材之一。目前，国内外学者对蒙药乌力地格的破痞功效作用机制尚未阐明，本研究通过建立人胶质瘤移植瘤模型，探讨蒙药乌力地格对胶质瘤生长的影响并初步探讨相关作用机制。

1 材料与方法

1.1细胞培养与扩增人脑胶质瘤细胞系U251购自中国科学院上海生命细胞库。将U251细胞系培养在含有10%胎牛血清(美国，Invitrogen公司)，1%链霉素(美国，Sigma-Aldrich公司)和青霉素(美国，Sigma-Aldrich公司)的DMEM(美国，Invitrogen公司)中，在37℃下含有5%的二氧化碳的潮湿培养箱中培养。取对数生长期的胶质瘤细胞用0.25%胰酶(美国，Invitrogen公司)消化后，800 rpm离心5 min后，细胞计数，用PBS将胶质瘤细胞稀释为1×107个/ml，用于接种。

1.2乌力地格提取物制备取1 kg乌力地格，浸泡于95%的乙醇溶液中，置于圆底烧瓶中加热浸煮，每次煮 3 h，提取 3 次，将3次所得的煮液合并为提取液，减压浓缩干燥后得浸膏，用于后续实验。

1.3移植瘤模型建立与分组24只SPF级6-8周龄雄性BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，所以实验动物均饲养在无菌环境下。取100 μl稀释好的胶质瘤细胞1×106个接种于裸鼠左侧肩胛区，将注射器针头留在原位1 min后缓慢慢拔出针头，然后监测动物的恢复情况。待肿瘤细胞接种后第7天，将裸鼠(n=24)随机分为4组(n=6/组)：对照组(无菌生理盐水)，低剂量治疗组(蒙药乌力地格 10 mg/kg)，中剂量治疗组(蒙药乌力地格20 mg/kg)和高剂量治疗组(蒙药乌力地格40 mg/kg)，灌胃给药，每天给药1次，每隔1天测量肿瘤变化，计算肿瘤体积，给药14天后，脱臼处死裸鼠，并取出肿瘤称重记录。所有实验伦理和动物研究均经伦理委员会批准。

1.4ELISA方法将肿瘤组织用RIPA缓冲液裂解，用组织研磨器进行匀浆处理，离心后取上清，使用ELISA凋亡试剂盒检测细胞凋亡情况，按产品说明方法进行操作，于405 nm波长处检测不同组OD值。凋亡细胞率以富集系数 EF 表示，EF值=(待测样品 OD 值-本底 OD值)/阴性对照 OD 值×100%。

1.5qRT-PCR方法将肿瘤组织加入1 ml Trizol试剂(美国，Invitrogen公司)，用组织研磨器匀将处理并提取RNA，通过SYBR Green PCR kit(美国，Takara公司)和ABI 7500 FAST Real-Time PCR system(美国，Thermo Fisher)检测试剂盒，根据产品说明书，检测PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达。反应条件如下：95℃预变性30s，95℃变性5 s，60℃退火35 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，反应40个循环。通过2-ΔΔCt方法相对定量评估RNA表达，GAPDH mRNA作为 mRNA的内参。引物序列如下：PI3K正向引物5′-TGAGCACATACAACGACCAAT-3′，反向引物5′-ACCATCAGCTTCTTCCCATC-3′；AKT正向引物5′-AGCGCCTGTTCAGTGGTTTA-3′，反向引物5′-ATTGGTTCCGTTCTCCGTGT-3′，mTOR正向引物5′-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，反向引物5′-CCTCGGGGCATCGGAA-3′。

1.6Westernblotting方法用RIPA缓冲液(美国，Thermo Scientific公司)裂解神经胶质瘤组织，从裂解缓冲液中提取蛋白质样品，并使用BCA试剂盒Pierce(美国，Thermo Scientific公司)检测蛋白浓度。将等量的蛋白样品经12%SDS-PAGE凝胶电泳分离，聚二氟乙烯膜PVDF(美国，Millipore公司)用于蛋白质转移，然后将PVDF膜用含有5%脱脂奶粉的PBST在室温下封闭1 h，封闭结束后，加入相应一抗，4℃下孵育过夜。一抗：PI3K(1∶1000，美国，Abcam公司)、AKT(1∶1000，美国，Abcam公司)、mTOR(1∶1000，美国，Abcam公司)、LC3-Ⅰ(1∶1000;美国，Sigma-Aldrich)、LC3-Ⅱ(1∶1000，美国，Sigma-Aldrich)、Beclin-1(1∶500，美国，Santa Cruz公司)。第2天用PBST洗涤后，将PVDF膜与二抗(1∶5000，美国，Invitrogen)在室温下孵育1 h。然后使用Super ECL Plus(美国，Thermo Scientific公司)捕获目的条带，并使用ChemiDocTM XRS+ system (美国，Bio-Rad)检测。β-tubulin为内参。

1.7统计分析本研究中的所有数据显示为3次独立重复结果的均值±标准差(x—±SD)，并使用SPSS 18.0软件和GraphPad Prism 6进行分析。P<0.05表示统计上显着性。

2 结果

2.1蒙药乌力地格抑制胶质瘤细胞移植瘤生长U251胶质瘤细胞接种于裸鼠左侧肩胛，待成瘤后，分别给予不同剂量的蒙药乌力地格(10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)，如图1所示，蒙药乌力地格抑制胶质瘤移植瘤的生长。与对照组比较，蒙药乌力地格呈剂量依赖性的抑制胶质瘤的生长。

图1 蒙药乌力地格抑制胶质瘤生长

2.2蒙药乌力地格诱导胶质瘤细胞凋亡为了确定蒙药乌力地格对胶质瘤生长的抑制作用是否与胶质瘤细胞凋亡有关，本研究通过ELISA检测了蒙药乌力地格对胶质瘤组织的凋亡的影响。结果显示，与对照组比较，蒙药乌力地格不同程度的促进胶质瘤细胞凋亡，随着给药剂量的增加，胶质瘤细胞凋亡显著(P<0.05)(图2)。

图2 蒙药乌力地格促进胶质瘤组织中细胞凋亡

2.3蒙药乌力地格抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活为了确定蒙药乌力地格对胶质瘤细胞凋亡的具体机制，本研究利用qRT-PCR和WB检测了不同实验组胶质瘤组织中PI3K、AKT和mTOR的mRNA和蛋白表达水平，研究结果显示，蒙药乌力地格抑制PI3K、AKT、mTOR的mRNA和蛋白水平，呈剂量依赖性，结果提示蒙药乌力地格抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活从而诱导胶质瘤组织中细胞凋亡(图3、图4)。

图3 蒙药乌力地格对PI3K、AKT和mTOR的mRNA表达的影响

图4 蒙药乌力地格对PI3K、AKT和mTOR的蛋白表达的影响

2.4蒙药乌力地格诱导胶质瘤细胞自噬为了研究自噬与凋亡的关系，本研究进一步检测了自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达情况。WB检测结果显示，与对照组比较，蒙药乌力地格上调自噬相关蛋白LI3的Beclin-1表达，随着蒙药乌力地格剂量的增加而增加，且随着药物浓度增加，LI3-I向L3-II转化增多(图5)。

图5 蒙药乌力地格促进胶质瘤细胞自噬

3 讨论

神经胶质瘤作为最常见的颅内恶性肿瘤，发生率为5/100000。胶质瘤显示出侵袭性生长，可在肿瘤周围2厘米范围内的正常脑组织中生长。由于恶性胶质瘤具有很高的生长能力，因此即使在手术切除整个肿瘤后，切口边缘仍无法避免其复发[5]。此外，化学疗法和放射疗法不仅没有特异性地杀死神经胶质瘤细胞，导致治疗效果差，而且还可能产生中枢神经系统毒性和严重的副作用。因此，即使联合治疗，预后和中位生存期仍远未达到预期。鉴于上述情况在近30年的临床实践中尚未得到根本改善，胶质瘤仍是神经外科手术中的难治性疾病[6]。因此，寻找新的有效的治疗药物仍然至关重要。

蒙药治疗恶性肿瘤具有独特的经验和方法，临床治疗过程中用药少，临床疗效显著，且毒副作用低等优点，蒙药的抗肿瘤作用及其相关作用机制的研究已成为当今医药学领域研究的重点。已有研究发现蒙药乌力地格可以抑制肝癌、宫颈癌细胞的增殖[7,8]，然而关于其对胶质瘤细胞的影响，国内外尚为空白。本研究通过建立U251胶质瘤裸鼠移植瘤模型，研究其对胶质瘤生长的影响。研究发现，蒙药乌力地格抑制裸鼠移植瘤的生长，随着给药剂量的增加，抑制作用增强，呈剂量依赖性。细胞生长受细胞凋亡和细胞增殖等调控，为了研究蒙药乌力地格抑制胶质瘤生长的作用机制，进一步分析了胶质瘤组织中胶质瘤细胞凋亡情况，结果显示随着给药剂量的增加，胶质瘤细胞凋亡显著。PI3K/AKT/mTOR信号通路广泛存在于真核细胞中，该信号通路通过调节细胞周期、细胞凋亡等多种途径发挥作用[9]。研究表明PI3K/AKT/mTOR信号通路在胶质瘤细胞中过度激活，提示该信号通路在胶质瘤的发生发展过程中具有重要作用。已有研究发现PI3K/AKT/mTOR信号通路与胶质瘤细胞凋亡有关[10]，本研究进一步分析了蒙药乌力地格对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响，结果显示蒙药乌力地格抑制PI3K、AKT和mTOR的mRNA和蛋白的表达，提示蒙药乌力地格通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路从而诱导胶质瘤细胞凋亡。

细胞自噬是真核细胞所特有的一种胞内代谢途径，细胞通过自我消化折叠错误的蛋白质或受损的细胞器，为机体提供物质能量从而保证大分子的合成[11]。自噬与肿瘤的发生、发展密切相关。有研究证明自噬能够诱导肿瘤细胞发生凋亡[12]。本研究观察到蒙药乌力地格促进胶质瘤细胞的自噬作用，而关于蒙药乌力地格诱导的自噬作用是否与凋亡相关，需进一步研究。

综上所述，本研究发现蒙药乌力地格抑制U251胶质瘤裸鼠移植瘤的生长，其通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导U251胶质瘤细胞凋亡，并诱导细胞自噬发生。