胶体金免疫层析法快速检测血培养肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的对比研究

刘泽世，呼 瑞，李 靖，殷 鉴，耿 燕，白 露

(1.西安交通大学第二附属医院检验科， 陕西 西安 710004； 2. 西北妇女儿童医院重症监护室， 陕西 西安 710061； 3. 空军军医大学西京医院检验科， 陕西 西安 710032)

碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(carbapenem-resistant enterobacterales,CRE)引起的感染与较高的发病率和病死率显著相关，在CRE引起的血流感染中，病死率可高达53.1%[1-2]，患者疾病负担重。一项流行病学调查发现，我国89% CRE产生碳青霉烯酶[3]，可用于治疗产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌(carbapenemase-producing enterobacterales,CPE)的药物极少，替加环素、黏菌素以及头孢他啶/阿维巴坦是目前国内主要的治疗药物。而对不同类型的碳青霉烯酶，头孢他啶/阿维巴坦体外抗菌活性作用不同：头孢他啶/阿维巴坦对金属酶无效，但对丝氨酸酶、AmpC酶以及ESBL酶敏感[4-5]。据报道，对于CRE血流感染的治疗，初始抗菌药物的治疗对提高患者生存率有重大的临床意义[6]，因此，快速检测血流感染中产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌并进行碳青霉烯酶型的鉴定，对早期优化抗菌药物治疗和提高生存率是必不可少的。本研究旨在评估两种商品化胶体金试剂对碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌五种主要碳青霉烯酶[klebsiella pneumoniae carbapenemase(KPC)、new delhi metallo-β-lactamase(NDM)、verona integron-encoded metallo-β-lactamase(VIM)、imipenemase metallo-β-lactamase(IMP)、oxacillinase48(OXA)-48]的检测能力，以期为临床CPE的诊断、治疗以及感染控制提供参考数据。

1 资料与方法

1.1菌株来源 复苏西安交通大学第二附属医院2019—2020年血培养标本阳性非重复CRE57株和碳青霉烯类敏感肠杆菌目(carbapenem-Sensitive Enterobacterales,CSE)22株，包括肺炎克雷伯菌41株，大肠埃希菌14株，阴沟肠杆菌12株，产酸克雷伯菌6株，弗氏柠檬酸杆菌3株，产气肠杆菌3株。

1.2主要仪器与试剂 VITEK-Ⅱ-COMPACT鉴定仪(BioMérieux公司，法国)，血平板、麦康凯平板(安图公司，郑州)，NG-Test CARBA 5检测试剂盒及阳性血培养物检测样品制备试剂盒(中生众捷生物技术，长沙)，金山川碳青霉烯酶耐药检测试剂(金山川科技发展有限公司，北京)。

1.3菌株鉴定 复苏57株血培养细菌，经VITEK-Ⅱ-COMPACT鉴定仪鉴定均为肠杆菌目细菌，且对碳青霉烯类药物耐药。

1.4NG-Test CARBA5 滴入5滴(约150 μL)提取缓冲液于无菌EP管中；1 μL接种环取一环细菌样本置于含150 mL提取缓冲液的EP管中，使用涡旋振荡器混合振荡几秒钟使之混合均匀；一次性移液管吸取100 μL制备好的混合液，加入到检测卡盒上标记了“S”的样本孔，加样后于室温下放置15 min，在20 min内读取结果。

1.5金山川碳青霉烯酶耐药检测 试剂盒与接种待测菌株血平板恢复至室温后，于无菌EP管中滴加10滴样本处理液，使用无菌接种环挑取适量菌株至EP管中，充分搅拌，使溶液混合混匀，用移液枪吸取50 μL稀释后的样本加至检测卡的加样孔处，10 min后读取结果。

1.6统计学方法 以PCR测序结果为标准，计算NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐药检测的敏感度、特异度。

2 结 果

2.1碳青霉烯酶基因的检测对57株CRE和22株CSE采用PCR方法检测碳青霉烯酶基因(blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like,blaIMP和blaVIM)。PCR所用引物与条件参考Poirel等的研究[7]。对PCR阳性扩增产物进行测序，并应用GenBank中Blast进行序列比对。结果显示，57株CRE均检出碳青霉烯酶基因，包括blaKPC(n=26)、blaNDM(n=21)、blaIMP(n=3)、blaKPC+NDM(n=3)、blaNDM +IMP(n=4)。22株CSE菌株未检测到任何碳青霉烯酶基因。

2.2胶体金免疫层析法酶型检测 57株CRE经NG-Test CARBA 5可检测出酶型KPC(n=26)、NDM(n=21)、IMP(n=3)、KPC+NDM(n=3)和IMP+NDM(n=4)。经金山川碳青霉烯酶耐药检测可检测出酶型KPC(n=27)、NDM(n=23)、IMP(n=3)、KPC+NDM(n=2)和IMP+NDM(n=2)。大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、产气克雷伯菌和弗氏柠檬酸杆菌均产单一酶型，两种检测方法结果一致。肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌检出单酶型和双酶型，其中，单酶型菌株经NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐药检测结果一致；双酶型检测时，NG-Test CARBA 5均可检测出，而金山川碳青霉烯酶耐药检测在两种酶型时，部分菌株可检测到两种酶型，部分菌株仅可检测出一种酶型，存在漏检KPC或IMP。两种方法均未检测出VIM和OXA-48-like酶型。22株CSE经两种方法检测均未检出任何酶型。见表1。

表1 157株CRE和22株CSE经NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐药检测酶型检测结果Table 1 Isoenzyme test results of 57 CRE and 22CSE by NG-Test CARBA 5 and Jinshanchuan carbapenemase resistance test

3 讨 论

碳青霉烯酶的快速检测有助于预防和控制产碳青霉烯酶细菌所引起的院内传播和感染。而快速鉴定碳青霉烯酶的类型有助于指导治疗产碳青霉烯酶细菌的感染。据报道，blaKPC-2和blaNDM是我国碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌中最常见的碳青霉烯酶基因[8]。我国耐药监测网监测数据显示，CRE耐药形势严峻，肺炎克雷伯菌作为CRE中耐药率上升最快的细菌，其对碳青霉烯类药物(美罗培南)的耐药率已由2005年的2.9%攀升至2020年的26.4%。中国一项CRE碳青霉烯酶分布调查显示[9]，产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌高97.4%，在成人和儿童中分别流行KPC-2和NDM酶，对产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌快速、准确地检测，有助于合理选择抗菌药物治疗，减缓细菌产生耐药性，预防和控制产酶菌株的传播。此外，若能进一步快速准确的区分碳青霉烯酶类型，对指导产碳青霉烯酶肠杆菌目细菌感染的治疗具有重要意义。据报道，大多数产KPC-2或OXA-48样碳青霉烯酶菌株对国内2019年新上市的酶抑制剂复合制剂头孢他啶/阿维巴坦有抗菌活性，相反，产金属酶(NDM、VIM、IMP)菌株对头孢他啶/阿维巴坦不敏感，临床需根据药敏结果考虑使用其他抗菌药物，如替加环素、黏菌素或氨曲南/阿维巴坦[10]。

目前临床实验室开展了诸如Carba NP试验、改良碳青霉烯灭活试验、碳青霉烯酶抑制剂增强试验等表型检测方法检测碳青霉烯酶。Carba NP试验操作简单，并可快速(4～6 h)得出阳性结果，检测碳青霉烯酶的敏感度在73%～100%不等，适合所有临床微生物实验室开展，但此方法因某些特殊试剂有效期短，需自制，颜色判断受主观因素和培养基种类的影响，且对于某些类型碳青霉烯酶(如OXA-48，-23)检测水平较低，不推荐作为常规检测方法[11-13]。值得注意的是，虽然近年来上市了一些基于Carba NP试验的商品化试剂，如Neo-Rapid Carb screen，Carb Blue screen和in-house Carba NP等，但依然未克服对OXA-48-like型碳青霉烯酶检测敏感度低的弊端[14-15]。

改良碳青霉烯灭活试验(modifified carbapenem inactivation methods,mCIM)检测碳青霉烯酶敏感度为93%～100%、特异度为97%～100%，当mCIM和EDTA-CIM 检测金属碳青霉烯酶时，敏感度为89.3%，特异度为98.7%。联合使用可判断出肠杆菌目细菌产生碳青霉烯酶的种类，但此种方法的不足之处在于需过夜孵育，延长临床周转时间，若存在同时产丝氨酸酶和金属β-内酰胺酶的菌株，eCIM会出现假阴性结果[16]。

同样，碳青霉烯酶抑制剂增强试验也需过夜孵育，其在检测产单一酶型(KPC和金属酶)时敏感度高(100%)，但检测同时产KPC和金属酶的菌株敏感度和特异度分别为96.8%和98.8%[17]，且无法检测到OXA-48酶。在肠杆菌中用硼酸衍生物(boronic acid derivatives，BA)和吡啶二羧酸(dipicolinic acid，DPA)/乙二胺四乙酸进行的碳青霉烯酶抑制试验。鉴定A、B和OXA-48类碳青霉烯酶的敏感性为95%、90%和100%，特异度为96%至100%[18]。

与表型检测方法相比，免疫层析法能快速简便地对临床上分离菌株进行碳青霉烯酶检测。有研究表明，NG-Test CARBA 5在血培养阳性标本中的敏感度和特异度分别在95.8%～97.7%和93.3%～96.1%之间[19-20]。NG-Test CARBA 5可以快速检测五种碳青霉烯酶：KPC、OXA-48-like、IMP、NDM和VIM，金山川碳青霉烯酶耐药检测亦可五种主要碳青霉烯酶：KPC、NDM、VIM、IMP、OXA-48。NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐药检测均是胶体金免疫层析法，一个测试盒即可完成对五种的酶型的测定，20 min内即可得到结果。对碳青霉烯类药物耐药肠杆菌目细菌已在全球蔓延，如何尽早检出并针对不同酶型进行优化治疗成为关键问题[21]。因此，检测碳青霉烯酶基因(如blaKPC、blaOXA-48、blaIMP、blaNDM和blaVIM)对于感染的控制和选择合适的抗感染治疗均至关重要。 尽早的检出五种酶型，可以及时将头孢他啶阿维巴坦与其他β-内酰胺/ β-内酰胺酶抑制剂联合使用。五种酶型是肠杆菌目细菌常见的碳青霉烯酶型，可以区分丝氨酸β-内酰胺酶与金属β-内酰胺酶，不仅有助于优化抗生素管理，改善预后，甚至可以预防出现进一步耐药[22-23]。

本研究中，57株CRE分离株和22株CSE分离株经NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐药检测。无论单一酶型或双酶型时，NG-Test CARBA 5对KPC、NDM、IMP、KPC+NDM和NDM+IMP的检测率均为100%，且与PCR结果一致，没有假阳性。金山川碳青霉烯酶耐药检测可有效检测单一酶型，且与NG-Test CARBA 5符合率可达100%。但当存在双酶型时，金山川碳青霉烯酶耐药检测部分菌株可检测出双酶型，部分菌株只能检测出其中一种酶型，存在漏检IMP或KPC酶型，这可能与两条带表达的强度有关[24-25]。金山川碳青霉烯酶耐药检测没有假阳性。

两种胶体金方法操作简单，能快速准确的区分碳青霉烯酶酶型，有助于简化临床上常规检测碳青霉烯酶的工作流程，适用于临床快速诊断碳青霉烯酶并进行酶型区分，为临床提供确切的碳青霉烯酶型别，优化治疗方案。而可能由于VIM流行率较低的原因，本次研究中并未检测到VIM。NG-Test CARBA 5和金山川碳青霉烯酶耐药检测无法区分OXA-48-like的变异体(OXA-48-、OXA-181-、OXA-163-、OXA-232-和OXA-405型碳青霉烯酶)，如果菌株存在上述变异体型碳青霉烯酶，则可能被认为未产OXA-48-like碳青霉烯酶，从而得到假阴性结果。这些检测方法的检测范围有限，仅涵盖了常见的碳青霉烯酶，可能会漏检其他碳青霉烯酶，如GES、IMI和GIM等。本实验中未检测到VIM和OXA-48酶，其原因之一可能是因为VIM和OXA-48在我国流行率不高，二是标本量不充分，未能涵盖到这两种酶型，我们仍需收集产VIM和OXA-48酶菌株，以期对两种胶体金方法检测五种主要的碳青霉烯酶的性能进行更全面的评估。

总之，两种试剂都为检测所有常见碳青霉烯酶提供了一种新的方法，适合于大面积初筛以确定是否产碳青霉烯酶，两种检测方法结合使用可以更好的减少CRE的发生率，在控制感染暴发应用前景广阔[26]。