声带任克水肿与咽喉反流的相关性研究

龚霞 王晓云 杨丽 杜俊 张伟

声带任克水肿是一种常见的声带良性增生性病变，其特点是声带任克层全长黏膜下高度水肿，可累及声带上表面或喉室,是导致嗓音障碍的常见疾病[1]。声带任克水肿的病因尚不明确，长期吸烟是目前比较公认的相关因素[2，3]，其次为用声过度或用声不当和甲状腺功能低下等。近年来的研究提出喉咽反流也是引起任克水肿的重要因素之一，然而，由于咽喉反流缺乏客观准确且被广泛认可的诊断方法，也导致了研究的困难性，所以相关的研究结论并不一致[3，4]。有研究指出，喉部胃蛋白酶的检测被认为是诊断咽喉反流的一种有效、客观、可靠的方法[5]。本研究拟通过检测声带任克水肿患者的声带组织病理标本中的胃蛋白酶表达，初步探讨咽喉反流与任克水肿的相关性。

1 资料与方法

1.1任克水肿与正常喉组织标本的收集 选取2015年1月～2017年12月在北京医院诊断为声带任克水肿且接受住院手术治疗的32例患者，均在全麻支撑喉镜下经微瓣技术切除声带粘膜下病变组织送病理检查(任克水肿组)，其中男19例，女13例，年龄38～68岁，平均53.53±8.71岁；取同期进行尸检的29例既往无喉部疾病患者的声带组织标本作为对照组，其中男21例，女8例，年龄46～99岁，平均89.72±10.42岁，所有尸检标本均在死亡后6小时之内取材，且均有家属签署的尸检同意书，取材部位为正常声带粘膜组织。以上两组的排除条件：①因各种原因曾行喉部手术；②头颈部曾接受过放射治疗和/或化疗。

1.2免疫组化染色检测两组声带组织中的胃蛋白酶含量 标本收集完毕后，在同一批次、同一条件下行免疫组化法检测两组声带粘膜内胃蛋白酶，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照，以胃粘膜主细胞作为阳性对照，Maxvision两步法免疫组化方法进行检测，一抗为兔抗人胃蛋白酶多克隆抗体(uscnlife，产品编号为P3635Rb-h,1∶75稀释)，二步法试剂盒为迈新公司抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒(产品编号KIT5030)。

由一名高年资的病理科医生进行免疫组化结果评定。免疫组化染色强度参照Formwitz评分方法，根据显色情况及阳性细胞的阳性率(每片随机观察5个高倍镜视野，对其中的阳性细胞进行计数)分级。按鳞状上皮细胞的胞浆显色深浅评分，无显色为阴性，记0分，浅褐色为弱阳性，记1分，棕褐色为阳性，记2分，颗粒状深棕褐色为强阳性，记3分；按显色组织的比例评分：<25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。根据二者的乘积将染色程度分为4级：0分为阴性，记0分；1～4分为弱阳性，记1分；5～8分为阳性，记2分；9～12分为强阳性，记3分。

1.3统计学方法 使用SPSS 16.0软件进行统计学分析,胃蛋白酶免疫组化评定结果为等级资料，采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组声带组织中胃蛋白酶检测阳性率比较 任克水肿组标本胃蛋白酶强阳性5例(15.63%，5/32)，阳性13例(40.63%，13/32)，弱阳性8例(25.0%，8/32)，阴性6例(18.75%，6/32)；对照组标本胃蛋白酶无强阳性及阳性标本，弱阳性4例(13.79%，4/29)，阴性25例(86.21%，25/29)；两组比较差异有显著的统计学意义(χ2=30.906，P<0.001)。

2.2两组声带组织免疫组化染色结果 两组的声带组织免疫组化染色后，任克水肿组有5例可见鳞状上皮细胞胞浆内大面积深棕褐色颗粒状的强阳性表达，13例可见鳞状细胞胞浆内较大面积棕褐色颗粒状的阳性表达，而对照组无一例强阳性及阳性表达病例；而对照组有4例、任克水肿组有8例声带组织鳞状上皮细胞胞浆呈面积不等浅褐色颗粒状的弱阳性表达，对照组有25例、任克水肿组有6例鳞状上皮细胞浆呈淡蓝色的阴性表达(图1)。

3 讨论

近年来研究发现，咽喉反流可能对声带任克水肿的发生起着重要的作用，并认为除了24小时双探针食管pH值监测之外，食管外胃蛋白酶检测是评估咽喉反流的另一个客观指标[5]；其方法主要包括唾液或痰液胃蛋白酶及喉粘膜胃蛋白酶检测，原理是胃蛋白酶是一种仅由胃粘膜主细胞分泌产生的蛋白水解酶，如果在胃食管外任何部位检测到胃蛋白酶，意味着胃内容反流至该部位。

胃酸或者胃蛋白酶长期刺激喉部黏膜可以导致包括声带任克水肿在内的喉部组织的显著改变[6]。目前，Belafsky设计的反流体征指数量表(reflux finding score，RFS)[7]在临床中被广泛应用于咽喉反流的诊断及反流严重程度的评估，而其中的两个评分项目就是不同程度的声带水肿及喉水肿，说明严重的咽喉反流会促使声带任克水肿的发生；Powell等[8]通过总结近些年咽喉反流的相关文献，也证实了声带任克水肿与咽喉反流密切相关。Koufman等[9]早期的研究已经证实，大多数声带任克水肿患者的24小时食管pH监测结果是异常的；Cohen等[4]研究发现,一部分因声带任克水肿导致声音嘶哑的患者常伴有咽喉反流现象, 给予抗反流治疗后,声嘶症状能得到缓解，并认为咽喉反流可能是导致该疾病的病因之一；Chung等[10]通过对110例声带良性病变患者进行24小时双探针pH值监测发现，90%的声带任克水肿患者都存在咽喉反流，故提出咽喉反流可能是该病的致病因素之一；Kamargiannis等[11]通过取40例声带任克水肿合并严重酸性反流患者的声带后联合粘膜送病理检查，发现有明显的炎症改变。本研究结果显示声带任克水肿组声带粘膜中胃蛋白酶有着不同程度的表达，阳性表达率明显高于对照组，说明任克水肿患者咽喉反流的发生率高于无声带病变者，提示咽喉反流尤其是反流物中的胃蛋白酶与任克水肿之间存在相关性，咽喉反流可能是声带任克水肿发生及发展的原因之一。

图1 任克氏水肿组及对照组喉组织中胃蛋白酶的表达 a.任克氏水肿组胃蛋白酶强阳性表达;b.任克氏水肿组胃蛋白酶阳性表达;c.任克氏水肿组胃蛋白酶弱阳性表达;d.任克氏水肿组胃蛋白酶阴性表达;e.对照组胃蛋白酶弱阳性表达;f.对照组胃蛋白酶阴性表达

值得一提的是，由于考虑到医学伦理学的因素，研究者很难取得到正常人群的正常声带组织作为对照组进行研究。本研究选择了尸检标本中无咽喉部相关疾病且肉眼检查正常的声带作为正常对照组，国内尚无类似报道；而既往的一些相关研究往往无对照组或是通过取自身病变旁组织作为正常对照组，但是实际上病变组织及病变旁组织处于同一致病环境中，故所谓的病变旁“正常组织”并不能算是真正意义上的正常组织，易产生实验误差。另外，正常组也有4例标本出现了胃蛋白酶的弱阳性表达，进一步提示喉部正常的人群也存在着咽喉反流现象，但是否会导致正常声带病变的发生，可能与反流的程度、次数以及是否合并吸烟、嗓音滥用等多因素有关。由于本研究未将其他相关因素纳入研究，尚存在不足，今后需要结合多因素研究进行深入探讨。

总之，结合既往及本研究的结果，提示咽喉反流可能是声带任克水肿发生的重要致病因素之一；建议临床上对于声带任克水肿的患者应该常规进行咽喉反流的评估及抗反流治疗。