SC对敏感菌种在口腔内黏附能力的影响

黄 丽，孙传孔，彭若冰，刘志明，毛甜甜，彭友俭

(武汉大学人民医院，湖北 武汉 430060)

敏感菌属于一种条件致病菌，存在于机体中的口腔、胃肠道等多种部位，参与机体生态平衡的调节[1]。 近年来，临床上因为大量使用抗生素及一些免疫抑制剂，使得患者的机体免疫力降低，机体中的菌群发生失衡，使敏感菌大量繁殖，敏感菌感染率不断增高[2]。 相关资料显示，敏感菌致病力与其黏附性密切相关，敏感菌感染发生的必要条件是黏附于宿主细胞上[3]。唾液对预防口腔敏感菌感染具有非常重要的作用,特别是多聚免疫球蛋白受体pIgR的胞外段——唾液中分泌片SC,可与敏感菌细胞壁外层的糖蛋白结合,在抗敏感菌感染中扮演着十分重要的黏膜免疫作用[4]。目前，有关唾液中SC对不同敏感菌黏附宿主细胞影响的研究报道尚少。本实验通过观察唾液中SC对临床中常见的敏感菌S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176黏附口腔上皮细胞能力的影响,旨在为临床深入了解敏感菌的致病性和防治提供有价值的参考。

1 实验资料

1.1实验材料和仪器 S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176(武汉大学菌种保存中心提供)；YEPD培养基(Sigma公司)；分泌片SC免疫放射试剂测定盒(上海恒远生物科技有限公司),TRIpure总RNA提取试剂(Sigma公司)， 荧光定量 PCR 试剂盒(上海恪敏生物科技有限公司)，其余试剂均为分析纯。恒温培养箱(北京福意电器有限公司),恒温摇床(上海晶坛仪器制造有限公司)，PCR 仪(西安天隆科技有限公司)。

1.2敏感菌的培养 将S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176接种在沙堡固体的斜面培养基，与来源于60例健康志愿者的口腔上皮细胞(采用无菌棉签刮取志愿者两侧的口腔颊部,采用PBS液离心洗涤3次,把口腔上皮细胞浓度调至105mL-1)进行混合培养。

1.3含SC及不含SC的唾液上清液制备 收集每例健康志愿者唾液3 mL,离心30 min,得到唾液上清液(即含SC的唾液上清液)。然后取上述唾液上清液各0.1 mL,滴入兔抗人SC血清0.1 mL,在37 ℃下180 r/min离心2 h,收集唾液上清液(即不含SC的唾液上清液)。采用放射免疫分析法测定上述上清液中SC浓度。

1.4黏附试验 分别将不含SC的唾液上清液、含SC的唾液上清液与敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞混合培养液，在37 ℃下180 r/min离心2 h后，运用PBS液洗涤3次,重悬至0.1 mL,然后分别和相应0.1 mL的口腔上皮细胞(浓度为105mL-1)在37 ℃下 180 r/min离心2 h,实施黏附试验操作,算出黏附率。

1.5ALS2与ALS3 mRNA表达检测 采用荧光定量 RT-PCR法检测。建立不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系和含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系，依据TRIpure总RNA提取试剂的说明书对培养液总RNA实施分离，采用紫外分光光度计测定RNA 水平，判定其纯度。经反转录试剂盒合成 cDNA后，实施特定引物 PCR 扩增。PCR 扩增依据张辉等[5]的方法进行。数据收集由定量 PCR 仪软件完成，目的基因相对表达量按照如下公式进行计算:△Ct = Ct目的基因 - CtGAPDH，△Ct值越高提示目的基因相对表达量越低。

2 结 果

2.1唾液上清液中SC浓度 60例健康志愿者唾液上清液所含SC的浓度为(354.62±34.53)μg/mL,处于正常参考范围，而滴入兔抗人SC血清进行处理过的唾液上清液中不存在SC。

2.2不同处理对口腔上皮细胞黏附率的影响 在不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系中，3种敏感菌的黏附率分别为(34.27±2.48)%、(30.61±2.35)%、(27.73±1.63)%，S.sanguis ATCC 10556黏附率最高，三者比较差异有统计学意义(F=19.654，P<0.05)；在含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系中，3种敏感菌的黏附率分别为(16.08±1.35)%、(20.02±1.24)%、(20.45±1.02)%，S.sanguis ATCC 10556黏附率最低，三者比较差异有统计学意义(F=13.031，P< 0.05)；且含SC体系中，3种敏感菌的黏附率均明显低于不含SC体系中3种敏感菌的黏附率(P均<0.05)。

2.3不同处理方式ALS2与ALS3 mRNA表达水平在不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系中，不含SC唾液上清液+S.sanguis ATCC 10556+口腔上皮细胞体系中ALS2 及 ALS3 mRNA表达水平最高，三者比较差异有统计学意义(P<0.05)；在含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系中，含SC唾液上清液+S.sanguis ATCC 10556+口腔上皮细胞体系中 ALS2 及 ALS3 mRNA 表达水平最低，三者比较差异有统计学意义(P<0.05)；且含SC体系中，3种敏感菌的ALS2 与 ALS3 mRNA 表达水平均明显低于不含SC体系中3种敏感菌的表达水平(P均< 0.05)。见表1。

3 讨 论

唾液中的SC在抗敏感菌感染疾病中有十分重要的作用。SC是由549～558个氨基酸组成的肽链, 含有较多的糖基(约20%),分为5个包含100～110个氨基酸的免疫球蛋白样结构域(D1-D5),与免疫球蛋白超家族的5个可变区有同源性[6-7]。纯化的重组人游离分泌片(rSC)结构与天然SC相似, rSC的建立为进一步阐明SC的结构提供了一个良好的平台。SC是S-IgA的重要组成部分，SC可增强S-IgA对蛋白水解酶的抵抗力，保护S-IgA的铰链区，有助于S-IgA的稳定性，使得S-IgA发挥免疫防御和稳定内环境的重要作用，构成黏膜免疫的第一防线[8]。SC的主要功能是介导细胞内多聚免疫球蛋白的转运和参与S-IgA的形成和分泌，直接参与非特异性免疫防御，可阻止感染的发生。目前研究证实，SC可以将黏膜上皮细胞下及固有层内的dIgA-pIgR/pIgM-pIgR复合物转运到腔隙表面,而且SC的结合可以保护抗体使其免遭蛋白酶的降解, 从而确保SIgA在黏膜免疫防御中发挥重要作用[9]。另外pIgA与重组SC结合之后,由于保护了抗体分子的氨基酸残基，故保护作用有所提高[10]。而在敏感菌感染疾病中,唾液中SC可与敏感菌细胞壁上的糖蛋白进行特异性结合,进而阻止敏感菌对细胞的黏附,达到黏膜免疫的目的。Lecatsas等[11]研究报道，艾滋病患者唾液中SC明显减少,可能与其容易发生口腔细菌疾病密切相关。

表1 不同处理方式ALS2 与 ALS3 mRNA 表达水平比较

注：①与不含SC体系比较，P< 0.05。

本研究结果显示，60例健康志愿者唾液上清液中SC浓度处于正常范围，而滴入兔抗人SC血清进行处理过的唾液上清液中不存在SC；在不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系中，S.sanguis ATCC 10556黏附率最高；在含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系中，S.sanguis ATCC 10556黏附率最低；且含SC体系中，3种敏感菌的黏附率均明显低于不含SC体系中3种敏感菌的黏附率。说明唾液中SC可与敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)结合,从而阻止敏感菌对口腔上皮细胞的黏附，且唾液中SC对S.sanguis ATCC 10556抑制能力更强；另外运用兔抗人SC血清能够中和唾液中SC,而该血清对上述敏感菌黏附口腔上皮细胞的作用没有明显影响。

有研究表明，ALS 家族中的ALS1～4 在念珠菌感染初期已经存在表达[12]。 本研究发现，在不含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系中，不含SC唾液上清液+S.sanguis ATCC 10556+口腔上皮细胞体系中ALS2 及 ALS3 mRNA表达水平最高；在含SC的唾液上清液+敏感菌(S.sanguis ATCC 10556，S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176)+口腔上皮细胞体系中，含SC唾液上清液+S.sanguis ATCC 10556+口腔上皮细胞体系中 ALS2 及 ALS3 mRNA 表达水平最低；且含SC体系中，3种敏感菌的ALS2 与 ALS3 mRNA 表达水平均明显低于不含SC体系中3种敏感菌的表达水平。说明ALS2 及ALS3 mRNA高表达可能为口腔敏感菌感染致病的一个重要机制，而唾液SC能够下调ALS2 及ALS3 mRNA表达，尤其对菌株 S.sanguis ATCC 10556作用明显。

综上所述，不同敏感菌的口腔上皮细胞黏附能力存在差异，菌株 S.sanguis ATCC 10556黏附能力强于S.mutans UA159，S.sobrinus OMZ-176。唾液SC能够抑制敏感菌对口腔上皮细胞的黏附,更易抑制菌株 S.sanguis ATCC 10556黏附口腔上皮细胞，其抑制机制可能与明显下调 ALS2 及 ALS3 基因表达有关。