大蒜素对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞顺铂化疗增敏作用及机制研究

郭燕军

(河北省沧州市中心医院，河北 沧州 061001)

舌鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，而舌部血供丰富、运动频繁，导致舌鳞状细胞癌生长快，浸润性强，转移率高[1]。目前，临床上主要采用传统手术结合放化疗的综合方案治疗，但化疗耐药性的产生往往导致疗效不理想甚至复发[2]。因此高效低毒化疗增敏剂是当前抗舌鳞状细胞癌药物研发的热点。大蒜素是一种天然存在的二烯丙基三硫化物，其对卵巢癌、宫颈癌、胃癌等均具有一定的抑制作用[3-5]，还能够增强大肠癌HCT-8细胞对奥沙利铂化疗敏感性[6]和人神经母细胞瘤细胞对环磷酰胺化疗敏感性[7]。顺铂为舌鳞状细胞癌的一线化疗用药，但大蒜素能否增强顺铂化疗敏感性、提高其疗效尚不明确。本研究通过体外培养人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞并给予大蒜素+顺铂联合干预，观察了大蒜素对舌鳞状细胞癌细胞对顺铂化疗的增敏作用，并初步探讨了其机制，现报道如下。

1 实验资料

1.1实验细胞、药物与试剂 人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株由河北医科大学病理生理学教研室惠赠。大蒜素注射液购自黑龙江迪龙制药有限公司(规格：2 mL∶30 mg)；注射用顺铂购自江苏豪森药业股份有限公司(规格：6 mL∶30 mg)；MTT、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司；Bcl-2、Bax、激活型Caspase-3多克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2实验方法

1.2.1细胞分组与培养 人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株经解冻复苏后常规体外培养，取对数生长期细胞进行实验。空白对照组正常培养，大蒜素组和顺铂组分别加入25 μg/mL大蒜素和40 μg/mL顺铂进行培养，联合组加入25 μg/mL大蒜素和20 μg/mL顺铂进行培养，每组设12个复孔，培养48 h后行相关指标检测。

1.2.2细胞生长抑制率测定 采用MTT法测定：各组细胞经胰酶消化并吹打成单细胞悬液，调整浓度为5×104mL-1后接种于96孔板(n=12)，继续培养24 h后，每孔滴加20 μL MTT溶液，继续培养4 h，滴加150 μL DMSO，避光震荡孵育10 min后通过酶标仪测定波长490 nm处的吸光度(A)值，细胞生长抑制率(%)=[1-(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)]×100%。

1.2.3细胞周期及细胞凋亡情况 采用流式细胞术检测：各组细胞经胰酶消化和PBS溶液洗涤2次后，制备浓度约1×105的单细胞混悬液，加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)混匀，避光孵育30 min后，分别加入400 μL缓冲液并混匀后通过流式细胞仪检测细胞周期并分析细胞凋亡情况。

1.2.4Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白表达检测 采用Western blotting法检测：经胰酶消化并离心取细胞后，加入适量冷裂解液后置冰上30 min后超声震碎10 s后，离心(13 000 r/min，4 ℃，20 min)取蛋白，经BCA法蛋白定量和高温变性后，经电泳、转PVDF膜、丽春红溶液染色后经5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(1∶500)Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3、β-actin 4 ℃孵育过夜，PBS洗膜3次，二抗(1∶100)室温孵育1 h后显色，然后根据条带灰度值半定量分析Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白表达情况。

2 结 果

2.1细胞增殖抑制率 空白对照组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖抑制率为0，大蒜素组为(24.8±3.9)%，顺铂组为(32.7±5.3)%，联合组为(49.7±6.8)%。大蒜素组、顺铂组和联合组细胞增殖抑制率均显著高于空白对照组(P均<0.05)，且联合组显著高于顺铂组和大蒜素组(P均<0.05)，顺铂组显著高于大蒜素组(P<0.05)。

2.2细胞周期 大蒜素组、顺铂组和联合组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞周期G2/M期比例显著高于空白对照组(P均<0.05)，顺铂组和联合组Tca8113细胞周期S期比例显著低于空白对照组(P均<0.05)；联合组Tca8113细胞周期S期比例显著低于大蒜素组和顺铂组(P均<0.05)，G2/M期比例显著高于大蒜素组和顺铂组(P均<0.05)，大蒜素组和顺铂组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞周期比较

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与联合组比较，P<0.05。

2.3细胞凋亡情况 大蒜素组、顺铂组和联合组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡数显著增多，以联合组最为显著，见图1。计算细胞凋亡率：空白对照组为(3.1±1.3)%，大蒜素组为(26.9±3.7)%，顺铂组为(44.2±5.8)%，联合组为(60.5±7.1)%。大蒜素组、顺铂组和联合组细胞凋亡率显著高于空白对照组(P均<0.05)，且联合组显著高于大蒜素组和顺铂组(P均<0.05)，顺铂组显著高于大蒜素组(P<0.05)。

2.4Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白表达情况大蒜素组、顺铂组和联合组Bax蛋白和激活型Caspase-3蛋白表达水平及Bax/Bcl-2比值均显著高于空白对照组(P均<0.05)，且联合组均显著高于大蒜素组和顺铂组(P均<0.05)；大蒜素组、顺铂组和联合组Bcl-2蛋白表达水平均显著低于空白对照组(P均<0.05)，且联合组均显著低于大蒜素组和顺铂组(P均<0.05)。见图2和表2。

图1 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡情况

图2 各组人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3蛋白表达情况

组别BaxBcl-2Bax/Bcl-2激活型Caspase-3空白对照组0.18±0.060.59±0.170.31±0.120.09±0.04大蒜素组0.24±0.09①②0.48±0.13①②2.08±0.79①②0.24±0.08①②顺铂组0.37±0.11①②0.45±0.12①②3.26±1.35①②0.37±0.11①②联合组0.50±0.14①0.21±0.07①4.55±1.68①0.51±0.13①

注：①与空白对照组比较，P<0.05；②与联合组比较，P<0.05。

3 讨 论

口腔颌面部肿瘤占全身恶性肿瘤的10%左右，其中口腔鳞癌最为多见。舌鳞状细胞癌占口腔癌的40%左右，且具有生长快、浸润性强、转移率高、预后差的特点，严重危害着人类的生命健康[8]。目前该病主要采用手术结合术前术后化疗方案治疗，预后较差，化疗耐药性的产生是疗效降低和复发的主要原因。因此研究高效、低毒的化疗增敏新型药物或许是提高抗肿瘤疗效、延缓复发的有效途径。

既往研究发现，大蒜素能够通过破坏细胞结构、阻滞细胞有丝分裂、抑制细胞增殖等抑制卵巢癌SKOV-3细胞、宫颈癌Hela细胞、胃癌MKN-45细胞生长，且具有时间和剂量依赖性[9-11]。此外，大蒜素的化疗增敏作用也逐渐得到医药研究工作者的关注。本实验研究发现，与单用顺铂组比较，联合组能够更加显著地将人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞周期阻滞于G2/M期，抑制细胞有丝分裂，显著提高Tca8113细胞增殖抑制率和凋亡率，提示大蒜素能够增强人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞对顺铂化疗敏感性。

细胞凋亡是一种多基因调控的程序性死亡过程，其中激活型Caspase参与细胞凋亡的启动及整个过程的调节[12]。Bcl-2基因家族中的Bcl-2能够抑制细胞色素C释放和Caspase-3激活，调节细胞内钙浓度，具有抑制细胞凋亡的作用[13]；而Bax具有破坏线粒体渗透性、激活Caspase-3而表现出促细胞凋亡作用[14]；Saeedi Borujeni等[15]研究发现Bax与Bcl-2能够聚合成二聚体，从而相互抑制活性，所以Bax/Bcl-2比值更能够体现二者对细胞凋亡的实际调控作用。本实验研究发现，与单用顺铂组比较，联合组能够更有效上调人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞Bax蛋白和激活型Caspase-3蛋白表达、下调bcl-2蛋白表达并提高Bax/bcl-2值；而与空白对照组比较，大蒜素干预能够有效下调人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞Bcl-2蛋白表达，提高Bax/Bcl-2值，上调Bax蛋白和激活型Caspase-3蛋白表达，这可能是大蒜素增强人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞对顺铂化疗敏感性的重要分子机制。

综上所述，大蒜素可增强人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞对顺铂化疗敏感性，可能与大蒜素抑制Tca8113细胞有丝分裂以及调节凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、激活型Caspase-3)表达有关。