目标外显子组捕获测序发现INPP5E突变致Joubert综合征1例

罗敏娜 刘志敏 沈 玥 王 昊 曹宗富 陈西华 马斯禹,3 高华方徐保平 彭 芸 马 旭∗

1.国家卫生计生委科学技术研究所(北京,100081);2.首都医科大学附属北京儿童医院;3.北京协和医学院研究生院

Joubert综合征(JS)是一种罕见的颅脑发育畸形疾病,发病率约为1∶100 000[1-2]。Joubert综合征诊断主要通过MRI结合临床表现来确诊,MRI显示的“磨牙征”(MTS)是其诊断的最重要特征[3]。Joubert综合征患者最主要的临床表现有:小脑蚓部发育不良或缺如、肌张力低、发育迟缓、阵发性呼吸过度或呼吸暂停、异常的眼球运动,在部分患者中还可能出现视网膜营养不良、肾脏疾病、眼组织缺损、肝纤维化、多指(趾)症等症状[2,4]。目前已有超过30个Joubert综合征的致病基因被发现,其中C5orf42、CC2D2 A、AHI1、CEP290、T MEM67等是最主要的致病基因[5-8]。Joubert综合征通常表现为常染色体隐性遗传的模式,仅在因OFD1所致的Joubert综合征的家庭表现为X连锁隐性遗传模式[2,7-9]。鉴于大部分Joubert综合征的致病基因都参与了纤毛的功能以及相关的信号途径调控,因此研究者们把Joubert综合征与Meckel综合征(MKS)、Bar det Biedl综合征(BBS)、窒息性胸廓发育不良(JATD)、常染色体隐性多囊肾(ARPKD)、常染色体显性多囊肾(ARPKD)、肾单位肾痨(NPHP)等其他因纤毛结构和功能异常而导致的人类疾病统称为“纤毛相关疾病(ciliopat hy)”,这些疾病之间不仅临床表现存在重叠,致病基因也有部分重合[10-12]。此前,解放军总医院301医院联合北京迈基诺基因科技有限责任公司研制了一套针对纤毛相关疾病的目标基因捕获技术平台[13]。本研究利用该捕获技术平台和高通量测序技术,对一个Joubert综合征的先证者DNA进行检测,分析测序数据并按照美国医学遗传学和基因组学学院(ACMG)的解读规则[14]进行解读,在父母中进行Sanger测序验证,发现了INPP5E基因上的2个杂合变异位点:c.1524C＞G以及c.1688G＞A是该Joubert综合征病例的致病原因,这是国内第1例报道INPP5E基因导致的Joubert综合征病例,且c.1524C＞G是之前未报道的新变异位点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本课题相关的样本采集及实验流程均由国家卫生计生委科学技术研究所伦理审查委员会审查通过。血样和临床资料的收集符合知情同意原则。用于高通量测序分析的血液样本取自首都医科大学附属北京儿童医院收治的Joubert综合征患者及其家属。家属签署了针对本研究的知情同意书。全血基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司,Taq酶、DNA mar ker购自全式金公司,PCR扩增引物由华大六合科技有限公司合成。

1.2 DNA提取和高通量测序

按照QIAa mp DNA Bl ood Mini Kit(Qiagen,德国)的操作说明从全血中提取基因组DNA,利用Qubit2.0(Invitrogen,美国)进行定量。取0.5μg待测样品DNA用超声仪(Covaris,美国)随机打成180～280bp的片段,利用包括113个纤毛疾病致病基因的外显子区域序列捕获试剂盒(北京迈基诺公司)进行目标基因捕获,构建文库,在Hiseq2500测序仪上(Ill u mina,美国)进行PE150测序。

1.3 测序数据分析

测序数据经去除污染等质量控制步骤用BWA软件以GRCh37.1/hg19基因组为参考序列进行比对。用GATK软件对SNP和In Del位点进行检测,用ANNOVAR软件同时关联dbSNP147、1000g、Ex AC、HGMD以及OMI M等数据库对所有变异位点进行注释,并进行初步过滤筛选,过滤标准为:① 保留突变碱基测序次数＞5的位点;②保留在正常人数据库以及内部数据库中没有出现过或者MAF≤0.01的位点;③去除同义突变位点;④保留文献报道的突变位点。根据ACMG的解读规则对过滤后的变异位点进行分级,确定可能的致病基因及变异位点,并利用MEGA6.0软件对不同物种的保守性进行分析。

1.4 Sanger测序验证

针对候选基因变异位点所在的外显子设计上下游引物,以患儿及其父母的基因组DNA为模板进行聚合酶链式(PCR)反应,并利用Sanger测序法进行验证。PCR引物序列见表1。PCR扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由ABI 3730xl完成Sanger测序;使用Chr o mas软件查看Sanger测序峰图,用Seq Man软件比对Sanger测序结果。

表1 CSPP1致病位点扩增引物

2 结果

2.1 临床表现

患儿,男,出生后5个月因“眼睑下垂、双眼不能追物”于北京儿童医院就诊。主要表现为双眼追视不灵,听声尚可,不会竖头,喜头后仰,向前打挺,能逗笑,会咿呀发音。患儿系第一胎第一产,足月,试产后失败转剖宫产,出生体重3.2kg,阿氏评分不详,无黄疸。母孕期无毒物、药物及射线接触史。否认近亲结婚,家族史无特殊。查体:头围44.2c m,前囟4.0×3.8c m,尚平坦;面纹对称,左眼睑下垂;四肢肌张力低,肌力尚可;膝腱反射能引出;脐疝;右手通贯掌。

2.2 辅助检查

听觉诱发电位反应通过;染色体核型46,XY;血氨基酸及尿有机酸代谢筛查无明显异常;肝、胆、胰、脾及泌尿系统超声均未见异常;颅脑MRI:T1 WI小脑上脚增粗,中脑呈磨牙状(图1),小脑蚓部发育不良,符合Joubert综合征的影像学特点。6个月时复诊行智商测定:适应性45分,大运动41分,精细运动33分,语言及个人社交各50分,属重度智力发育迟缓。此后进行康复训练治疗,至7～8个月时能抬头和翻身,头控欠佳,双眼能追物,9个月能坐,12个月能扶站,2岁10个月时可独走,步态不稳。

图1 患儿头部MRI影像图

2.3 测序质量及分析

目标靶向捕获测序共产出原始数据430.07 M,去除低质量的、污染的数据以后,得到416.5 M数据,目标捕获区域的平均测序深度为208.12×,≥1×测序深度下的覆盖度为98.7%,≥4×测序深度下的覆盖度为97.9%,≥10×测序深度下的覆盖度为96.6%,≥20×测序深度下的覆盖度为94.1%,数据质量符合实验设计要求。在经db SNP147、1000 g、ESP6500、Ex AC以及HGMD数据库的过滤筛选以后,发现了8号染色体上INPP5E基因(NM_019892.4)的2个错义突变位点。其中一个错义突变位点位于7号外显子区的1524位,由胞嘧啶突变为鸟嘌呤(c.1524C＞G),可导致其蛋白质翻译在第508位天冬氨酸变成谷氨酸。该位点在db SNP147、1000g、ESP6500、Ex AC中均未见人群频率的报道,未收入HGMD数据库,是罕见的变异位点,SIFT以及Phly Phen软件均预测有害,保守性分析显示508位的天冬氨酸在人、猴、小鼠、大鼠、牛、斑马鱼以及线虫的INPP5E中都非常保守(图2)。另一个错义突变位点是在9号外显子区的1688位由鸟嘌呤突变为腺嘌呤,可导致其蛋白质翻译在第563位精氨酸变成组氨酸。该位点在dbSNP数据库中的编号为rs121918128,在Ex AC中数据库中显示其突变频率为0.00005,Clin Var数据库将其定义为致病性变异,且已被 HGMD收录(ID:CM095406)。之前有多篇文献报道过该变异位点[15-16]。

2.4 Sanger测序验证

先证者的c.1524C＞G位点来自于母亲,c.1688G＞A位点来自于父亲,符合常染色体隐性遗传分离规律(图3)。其中,c.1688G＞A在过去的文献中已有报道[16],c.1524C＞G在所有已知的数据库中没有记录,属于极罕见的变异。由此判定,INPP5E基因的c.1524C＞G以及c.1688G＞A的复合杂合变异为该Joubert综合征患儿的致病性变异位点。

图2 INPP5E变异位点的保守性分析

图3 Sanger测序验证结果图

3 讨论

Joubert综合征最早于1969年被发现,是一种罕见的小脑发育畸形。Joubert综合征的临床表现具有很强的异质性,目前国际上将所有具有“磨牙征”的疾病统称为“Joubert综合征及相关疾病”(JSRD),并根据伴发症的不同将其分为6大类[17]。本文报道的家系先证者,小脑蚓部具有明显的“磨牙征”改变,小脑蚓部发育不良、四肢肌张力低,发育落后,符合Joubert综合征的基本特点。同时,该患儿无多指、肾脏、肝脏及眼睛相关并发症,考虑为单纯型的Joubert综合征。

目前国内已报道Joubert综合征病例80余例[18-20]。少数病例有致病基因及位点的报道,分别是 CC2D2 A[21-22]、CEP290[23]、OFD1[24]、C5orf 42[25]以及CSPP1[26]基因的突变导致的。国外研究表明,虽然JSRD的致病基因多达30多个,但是2/3患者的致病突变主要集中在C5orf42、CC2D2 A、AHI1、T MEM67、CEP290、CSPP1、KIAA0586这7个基因上,而T MEM231、ZNF423等基因突变则非常少见或者仅在特定的人种或特殊的家系中发现,占比不到1%[7,8,27]。本研究尝试用针对纤毛相关疾病的目标外显子组捕获测序来进行基因检测。所得测序数据经过标准分析流程,按照ACMG的解读规则[13]对变异位点进行解读,最终在已知的致病基因INPP5E中筛选到了候选的致病变异位点,c.1524C＞G及c.1688 G＞A,后者是已经报道的致病变异位点。蛋白质保守性分析显示这两个氨基酸位点在不同物种间非常保守,提示该位点的氨基酸改变可能对蛋白功能有重要影响。经PCR扩增及Sanger测序验证,表明INPP5E的c.1524C＞G及c.1688 G＞A的复合杂合变异符合遗传共分离的规律,为该患者的致病性变异位点。

早在1999年,Saar等[28]在2个近亲结婚的阿拉伯Joubert综合征家系中发现9号染色体长臂的D9S158位点附近的LOD值为3.7,提示该区域存在Joubert综合征的致病基因。直到2009年,Jacoby等[15]通过对7个Joubert综合征家系的连锁分析定位到了9q34.2区域,并在INPP5E基因上发现了6个不同的错义突变,进一步证实了INPP5E与纤毛相关疾病的联系。此后在一些不同的研究都发现了由INPP5E导致的JSRD病例。INPP5E基因位于9号染色体,该基因编码的蛋白质是磷脂酰肌醇-5-磷酸酶(INPP5E),分子量为70205 Da,由644个氨基酸组成。INPP5E的主要功能是催化PI(3,4,5)P3与PI(4,5)P2分别生成PI(3,4)P2与PI4P。Jacoby等[29]研究发现鼠胚的成纤维细胞经过血清饥饿以后诱导产生初级纤毛,INPP5E定位于纤毛的轴丝中。INPP5E的失活并不影响纤毛的组装,但是加入血清以后会破坏纤毛内已建立的稳态。阻断磷酸肌醇-3-磷酸酶(PI3 K)的活性或者阻断纤毛中血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)可以修复纤毛的稳态。Bielas等[15]研究发现与JSRD有关的INPP5E错义突变主要集中分布在磷酸酶结构域中,影响了磷酸酶的活性,导致细胞内磷酸肌醇的浓度改变,使得纤毛在外界刺激时表现不稳定。2016年,Xu等[30]用模式动物斑马鱼研究了INPP5E的作用机制,他们发现INPP5E在肾脏上皮细胞中是一个关键的细胞极性调控因子,它通过水解抑制PI(3.4.5)P3从而稳定PI(4,5)P2在细胞表面的分布,同时募集Ezrin和F-actin并把基体(basal body)锚定到细胞表面,从而促进纤毛生成。Har dee等[31]发现在INPP5E突变导致的Joubert综合征患者的成纤维细胞表现出无纤毛或者短纤毛的表型,表明这些患者的纤毛发生和维持机制受到了损害。

本文采用目标捕获测序技术,结合Sanger测序验证,检测到了Joubert综合征家系中INPP5E基因的两个杂合变异(c.1524C＞G及c.1688 G＞A),是国内首次报道由INPP5E基因变异引起的Joubert综合征病例,其中c.1524C＞G是新发现的变异位点。这一研究结果不仅拓宽了INPP5E的突变谱,也为将来可能进行的产前诊断提供了分子基础。