云南凤庆“大山茶”的 生化成分测定

段双梅,郑吉文,李永席,李正华,石兴云,王利妍,郭天杰,吕才有,赵 明,马 燕,*

(1.云南农业大学龙润普洱茶学院,云南昆明 650201; 2.云南省德宏州茶叶技术推广站,云南德宏 678400)

茶树[Camelliasinensis(L.)O. Kuntze]是山茶科(Theaceae)、山茶属(Camellia)多年生常绿木本植物[1]。云南是世界茶树起源的中心,保存了丰富的茶树种质资源,为茶学遗传多样性研究提供宝贵的研究材料[2]。凤庆位于滇西南,在北回归线附近,具有立体气候特征,被誉为世界滇红之乡,中国红茶之都[3]。凤庆拥有丰富的茶树种质资源,是目前全国范围内古茶树最多的地方之一[4],也是世界茶树发源地中心地带之一[5]。全县古茶树资源面积56000多亩,包括栽培型、“半野生”型、野生型古茶树,有多达31600多亩野生古茶树群落,约有126600棵野生古茶树[5]。凤庆当地良种也比较多,包括凤庆大叶群体种,野生苞红茶、勐库大叶种[5]、香归银毫、清水3号、凤庆7号、凤庆9号、探春银毫、早春翠芽、华丰28号等[6]。

“大山茶”是近年来凤庆地区新近发展起来的一个地方栽培材料,主要分布于凤庆的诗礼(成片分布)、小湾、大寺、洛党镇、三岔河、凤山镇等地。其叶质柔软、嫩叶油亮及顶芽均无茶毫。现主要用于加工红茶,当地称为“野生红”,干茶外形乌润,香气独特,汤色金黄油亮;滋味浓醇鲜甜,深受广大消费者的喜爱。野生大山茶的树型大小各异,分布散,由于生态环境优越,物种多样性丰富,食物链(网)结构复杂,不易发生病虫害[7]。在野生“大山茶”的基础上,许多茶农通过幼苗扦插、嫁接等技术,正在扩大“大山茶”的种植面积。前期杨崇仁、张颖君等研究认为“大山茶”是由大理茶引种[8],经长期的杂交变异,形成了外观形态及内在品质都存在显著差异的多种茶树类型[8]。段志芬等人利用常规方法测定86份云南野生茶树样品,并进行聚类分析,其中大山茶聚在第三类,主要特征为水浸出物和茶多酚的含量较高[9]。但目前未见对“大山茶”的种质资源进行评价的研究报道。

本文对“大山茶”常规生化成分含量进行了测定,应用HPLC-MS/MS研究其化合物组成,为系统评价其种质资源和开发利用提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶样 本实验材料均采自云南凤庆,分别为“大山茶”、云抗-10#、香归银毫、凤庆九号、凤庆大叶种,鲜叶采摘标准为一芽二叶,杀青，揉捻,日晒至足干;甲醇、乙腈 色谱纯,美国TEDIA试剂公司;乙醇、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、醋酸乙酯、正丁醇、乙醇、碳酸氢钠、草酸、三氯化铝、磷酸盐、茚三酮、蒽酮、茚三酮、福林酚试剂、焦性没食子酸 均为国产分析纯试剂;标准品没食子酸(GA)、儿茶素(C)、咖啡碱(CA)、表没食子酸儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、1,4,6-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(G-G)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG) 均购自天津一方科技有限公司。

高效液相色谱仪1200型 美国Agilent公司:包括UV检测器 安捷伦1200VWD G1314B;柱温箱 安捷伦1100/1200 G1316A;自动进样器 安捷伦1100-1200 温控自动进样器 G1329A;在线脱气机 安捷伦1100/1200 G1322A;溶剂输送泵 安捷伦1100/1200四元泵G1311A和TSKgel ODS-80TM色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 日本TOSOH;串联质谱仪(MS/MS)为Q Exactive high-resolution mass spectrometer(Thermo,USA),Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm,1.9 μm);756CRT紫外可见分光光度计;101A-2型电热鼓风恒温干燥箱 上海市崇明实验仪器厂;DZKW-S-8电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司;电子分析天平 奥豪斯仪器有限公司;HH-S28S数显恒温水浴锅 金坛市大地自动化仪器厂;CS-2000高速多功能粉碎机 武义海纳电器有限公司;Smart-Q30实验室蒸馏水机 上海和泰仪器有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 常规化学成分测定 应用差数法[10]、茚三酮比色法[11]、酒石酸铁比色法[12]和硫酸蒽酮法[13],测定茶叶水浸出物、游离氨基酸、茶多酚和茶多糖含量。

1.2.2 儿茶素、没食子酸和咖啡碱含量的测定

1.2.2.1 样品溶液的制备 称取1.0 g茶叶,研细,加入2%磷酸10 mL,再加入10 mL甲醇,混合静置1 h,过滤,滤液置于50 mL容量瓶,重复提取两次,定容。

1.2.2.2 对照品溶液的制备 称取GA、EC、EGC、EGCG、C、CA、GG和ECG标品0.01 g,至于50 mL烧杯中,加入8 mL色谱级甲醇,溶解,定容至10 mL。

1.2.2.3 测定方法 应用高速液相色谱系统,测定儿茶素类、咖啡碱。流动相A为0.261%磷酸,5%乙腈;流动相B为0.261%磷酸,80%乙腈;洗脱梯度程序:0～21 min B液从10%线性梯度增加至20%;21～22 min,B液从20%线性梯度增加至100%;22～26 min,B液100%保持不变;26～26.5 min,B液由100%线性梯度降低至10% B;27 min程序停止;以10% B液后运行平衡5 min;流速为1.0 mL/min;柱温为40 ℃,进样量2 μL。

分别配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2 μg/μL的各种标品溶液,每个浓度进样2次分析,以含量为横坐标,以峰面积为纵坐标,结果发现在0.01～2 μg/μL之间,各标品的含量与峰面积呈线性关系,R2均大于0.99(表1)。

表1 各标品的标准曲线方程Table 1 The formula of various standard curves

1.2.3 大山茶茶叶化学物质组成测定 茶样按1.2.2.1方法提取,应用LC-MS/MS分析大山茶样品提取物的化学物质组成。

1.2.3.1 超高效液相色谱条件 流动相A为0.05%甲酸水;流动相B为乙腈;柱温:40 ℃,进样量:5 μL,流速:0.3 mL/min;梯度洗脱程序:0～2 min,B液从5%保持不变;2～9 min,B液从5%线性梯度增加至50%;9～11 min,B液50%保持不变;11～15 min,B液由50%线性梯度降低至95%;15～18 min,B液由95%保持不变;18～18.1 min,B液由95%降低至5%;18.1～20 min,B液由5%保持不变;21 min程序停止。

1.2.3.2 质谱条件 串联质谱仪(MS/MS)为Q Exactive high-resolution mass spectrometer(Thermo,USA),喷雾电压:+3500 V/-3000 V;雾化温度:350 ℃;鞘气压力:35 arb;辅助气压力:10 arb;离子传输管温度:320 ℃;S-Lens RF:50 V;扫描模式:Fullscan-ddms2;扫描范围:m/z 135～2000;分辨率:70000(Fullscan)/17500(ms2)。

1.2.3.3 化合物鉴定 对样品质谱检测正负模式总离子流图中色谱峰进行提取,获得样品化合物一级、二级精确质量数和保留时间信息。根据一级、二级质谱图中产生的精确质量数信息,对谱图中产生的一级母离子和二级碎片进行元素组成的拟合;采用Mass Frontier软件对质谱信息进行解析,利用特征碎片进行结构归属从而完成化合物一级结构的合理推测。

1.3 数据处理

每个样品平行制备2份供试品溶液,每个溶液测定2次,以mean±SD表示。实验数据进行单因素方差分析,组间采用最小显著差数法进行两两比较,p<0.05为差异显著。统计分析与数据处理应用软件IBM spss statistics 22(SPSS Inc.,Chicago,IL)进行。化合物主要利用NCBI(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/)和Scripps Center for Metabolomics(https://metlin.scripps.edu/index.php)进行鉴定和分析。

2 结果与讨论

2.1 茶样生化成分测定

各样品水浸出物、游离氨基酸、茶多糖、茶多酚含量见表2,应用HPLC测定茶样儿茶素、咖啡碱含量,部分测定色谱图见图1。统计分析发现“大山茶”水浸出物含量为48.77%，与其它样品无显著差异(p>0.05),水浸出物含量决定了茶汤的汤色和滋味[14],测定结果表明“大山茶”具有云南大叶种茶树水浸出物高的特点,为其汤色和滋味品质特征提供了物质基础。茶多酚是茶汤的主要呈味物质,也是茶叶的主要功效物质,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗病毒等生物活性[15]。“大山茶”的茶多酚含量为36.01%,显著高于香归银毫和凤庆大叶种(p<0.05),与凤庆九号和云抗-10#样品无显著差异(p>0.05)。测定发现“大山茶”的游离氨基酸含量为1.66%,与已有报道相当,其酚氨比为21.6∶1,也表明其适制红茶。茶多糖具有降血糖、抗凝血、抗血栓、降血脂等保护心血管的作用,同时可抗辐射、抗氧化等增强机体免疫力[16]。表2结果显示“大山茶”茶多糖含量显著高于其他样品(p<0.05)。咖啡碱是一种黄嘌呤生物碱化合物[17],具有抗疲劳、兴奋神经、抗癌等作用,是茶叶重要的风味物质及生理活性特征成分[18],但是摄入过多的咖啡易造成高血压、心律不齐、流产等不良现象[19-20]。本研究中“大山茶”咖啡碱含量显著低于凤庆大叶种、凤庆九号和云抗-10#样品(p<0.05),与香归银毫无显著差异(p>0.05)。综合来看,“大山茶”具有茶多酚含量高、咖啡碱含量相对较低的特征。

表2 茶样生化成分含量Table 2 Contents of biochemical components in various teas

图1 茶叶儿茶素、咖啡碱测定色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of catechins and caffeine in tea extraction

2.2 “大山茶”提取物的LC-MS/MS分析

应用Thermo U3000 UHPLC超高效液相和Thermo QExactive高分辨质谱仪联用的方法,分别应用正离子模式和负离子模式检测鉴定“大山茶”提取物(图2),进行峰提取,获取化合物保留时间,通过一级、二级精确质谱信息确定化合物结构,从“大山茶”中共鉴定到了44种化合物(见表3)。利用NCBI的Compound数据库,上述化合物分别为:酸类11个、黄酮及黄酮醇类15个、酚酸5个、儿茶素类6个、氨基酸类3个、嘌呤碱类2个和未知2个。与已有的报道相比较,朱旗等[21]利用LC-MS分析普洱茶、茯砖茶和红茶化学成分,共鉴定22种化合物。本研究从大山茶中鉴定了44个化合物,增加了对茶树化学物质组成的认识。

表3 从大山茶提取物检测鉴定的化合物Table 3 Compounds identified in Dashancha

续表

图2 正负离子模式下测定的总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of Dsshancha by positive and negative ion mode注:a:正离子模式下测定的总离子流图; b:负离子模式下测定的总离子流图。

HPLC测定发现,“大山茶”中3.669、7.590、12.579 min的峰面积明显高于本实验中的同等质量的其它品种提取物(图1)。进一步通过LC-MS的方法,测定该3个化合物,在负离子模式下,分子量为343.07、633.07和785.09。对比LC-MS/MS结果(表2),将3.669 min的化合物初步鉴定为3-Galloylquinic acid(3-没食子酰基奎宁酸),7.590 min的化合物初步鉴定为Corilagin(柯里拉京),12.579 min的化合物需要进一步研究。Corilagin是水溶性鞣质,属天然植物多酚单宁酸类化合物[22],具有抗氧化、抗动脉硬化、抗肿瘤、抗病毒等生物学活性[23],可开发加工为食品添加剂、药物或保健品等。最早张玉玲从茶叶中鉴定到3-没食子酰基奎宁酸,并认为是绿茶中刺激性成分[24],而Stagg G V认为在红茶发酵过程中3-没食子酰基奎宁酸可能参与色素的形成[25]。本文测定发现“大山茶”的Corilagin和3-Galloylquinic acid峰面积高于相同质量的云抗10#提取物,其含量高低与“大山茶”生物活性以及加工红茶品质关系有待进一步研究。

3 结论

应用分光光度法和HPLC方法测定分析了“大山茶”在内的5个凤庆栽培品种或材料的儿茶素、咖啡碱、水浸出物、茶多酚、游离氨基酸、茶多糖等生化成分,其中“大山茶”茶多酚含量高,咖啡碱含量较低,酚氨比为21.6∶1,适制红茶。应用LC-MS/MS从大山茶中共鉴定出酸类、黄酮及黄酮醇类、酚酸、儿茶素等44个化合物。HPLC测定发现“大山茶”的3个峰的峰面积,高于同等质量其它品种提取物的对应峰面积,其中2个鉴定为柯里拉京与没食子酰基奎宁酸。综上,本文研究初步表明“大山茶”具有云南大叶种高水浸出物、高茶多酚的典型特征,并且部分化合物含量高于国家茶树良种云抗-10#,有望选育为新的茶树良种。