农产品中棉酚的检测技术研究进展

李凌慧,魏 月,吕 佼,杨舒妍,马晶军

(河北农业大学理工学院,河北沧州 061100)

棉酚是一种淡黄色的化合物,主要存在于棉花植物的根、茎、叶和种子内,植株的不同部位所含棉酚含量为0.04%～1.3%[1],棉籽仁中棉酚含量最高,大约为0.3～20 g/kg[2-3]。自然界中,棉酚主要以游离棉酚和结合棉酚形式存在[4],游离棉酚具有一定毒性,结合棉酚是游离棉酚与氨基酸、小肽等分子结合后形成的不具毒性的衍生化合物[5],通常不会对人体健康造成危害,生成的棉酚衍生物还具有改善糖尿病、抗生育、抗氧化活性、抗肿瘤及作为抗肿瘤药物、抗癌等医用价值[6-10]。棉籽粕作为质优价廉的动物饲料蛋白源之一[11-12],被畜禽大量摄入时,其中含有的游离棉酚会使畜禽出现食欲减退,呼吸困难,受精率下降等症状[13],并通过食物链的作用,蓄积在肉、蛋、奶等食物中,间接威胁人类健康。例如,雏鸭的饲料中游离棉酚含量达到320 mg/kg就会导致棉酚在雏鸭体内蓄积,损伤肝脏并且破坏代谢系统的正常运行[14]。2013年10月台湾大统长基食品公司被查出造假“黑心油”事件,其中粗制棉籽油高达5828.62 t,长期食用这种油的人就会出现棉酚中毒的症状[15]。

外国学者在检测农产品中棉酚是否存在及其含量方面的研究较少,大多都研究棉酚及其衍生物在医学领域的应用,这可能与中西方饮食文化差异有关。随着我国对农产品中棉酚危害认识不断加深,先后提出并修订了GB 13078-2017[16]和GB 2716-2005[17]两个国家标准,检测棉酚的技术也在不断发展,本文主要概述电化学分析技术、光谱分析技术、色谱分析技术和分子印迹技术的定量分析方法在农产品中棉酚含量检测领域的研究进展,为后期农产品中棉酚的定量分析研究提供一定的参考。

1 电化学分析法

电化学分析是仪器分析的重要组成部分之一。电化学分析法是根据物质在溶液中的电导、电势等电化学性质而建立的一类分析方法,电化学分析具有仪器设备简单、测量范围宽、操作方便等优点,便于与自动化技术联用容易实现自动化,易于微型化,适于现场测量,在食品质量安全检测中被广泛应用[18-20]。

1.1 极谱法

极谱法通过测定电解过程中所得到的极化电极的电流-电位(或电位-时间)曲线来确定溶液中被测物质浓度的一类电化学分析方法。极谱法是使用滴汞电极或其他表面能够周期性更新的液体电极为极化电极,分为控制电位极谱法和控制电流极谱法两大类。1922年,捷克化学家J.海洛夫斯基建立了极谱法[21],早在1984年,姜永等[22]介绍了极谱法测定棉酚的方法,通过改进测定条件,使实验结果的灵敏度更高。极谱法可用来测定大多数金属离子、阴离子(如F-、Cl-、I-)和有机化合物,在生物化学方面也有广泛的应用,具有适用范围广、精确度高、灵敏度高的特点[23],但极谱法使用汞电极会产生汞蒸气,危害人体健康,实验室应注意通风,所以此方法很少用于棉酚的定量分析。

1.2 库仑法

库仑分析法是以测量电解过程中被测物质在电极上发生电化学反应所消耗的电量来进行定量分析的一种电化学分析法,分为控制电位库仑分析法和恒电流库仑滴定法。1985年,姜永等[24]建立了TLC—溴库仑法测定棉籽中棉酚的方法,结果表明库仑法可以消除棉酚类似物的干扰,可用于棉酚样品及其制剂的测定。但是库仑分析法具有一定局限性,必须保证电极反应专一,电流效率100%才可以使用此方法。以上两种电化学分析法因具有各自的局限性,目前不再被用于棉酚的检测,但随着电子技术的发展,这可能为研究出新型电子检测技术提供依据。

2 光谱分析法

光谱分析方法是基于物质与辐射作用时,测量由物质内部发生的能级跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度,以此来鉴别物质及确定它的化学组成和相对含量的方法[25],光谱法分为吸收光谱法和发射光谱法两类。定量研究棉酚在农产品中的含量大多采用原子吸收法、近红外光谱分析法和紫外可见分光光度法。

2.1 原子吸收法

原子吸收光谱法是具有待测元素特征波长的光通过试样原子蒸气时,被测元素的基态原子所吸收,然后利用光被吸收的程度来测定被测元素含量的方法。原子吸收法更适合于定量分析,它是利用待测元素所产生的基态原子对其特征谱线的吸收程度来进行定量分析的,原子吸收法灵敏度高、精密度高、选择性好、干扰少并且应用范围广。董仕林等[26]应用原子吸收法测定棉籽油中游离棉酚,方法的检出限为100 μg/kg,平均回收率为99.8%,仪器的相对标准偏差为4.2%～6.8%。这种方法检测农产品中棉酚,精确度不高,稳定性相对较差,难以检测痕量棉酚,且仪器占地面积大、消耗材料贵。

2.2 近红外光谱法

近红外光谱分析技术被誉为化学分析领域的“巨人”,现如今发展迅速,在光谱分析技术中占有很重要的地位[27],通过扫描样品的近红外光谱,可以得到样品中有机分子含氢基团的特征信息,而且利用近红外光谱技术分析样品具有方便、快速、高效、准确和成本较低,不破坏样品,不消耗化学试剂,不污染环境等优点。Cheng Li等[28]使用近红外光谱联合蒙特卡罗无信息变量消除法与非线性多元校正相的方法联合可以快速、准确的定量分析棉籽中棉酚含量,预测均方根误差(RMSEP)为0.0422,决定系数(R2)为0.9331,残差预测偏差(RPD)为3.8374。由于棉酚在近红外区的吸收系数小,因此,红外光谱法对农产品中的痕量棉酚进行定量分析应用较少。

2.3 紫外可见分光光度法

紫外—可见分光光度计可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定和推断,应用广泛,不仅可以进行定量分析,还可以利用吸收峰的特性进行定性分析和简单的结构分析,灵敏度高、准确度高、选择性好、操作方便、分析速度快、应用范围广。1988年,张绍衡等[29]建立了紫外分光光度计测定棉籽油中的游离棉酚的方法,此方法的检出限为5000 μg/kg。这种方法虽然操作简单,但样品处理复杂,易受杂质干扰,棉籽油样品易乳化,使检测值偏高。田秀芸等[30]在此基础上改进了前处理方法,用Mg(NO3)2作为破乳剂以消除乳化现象,分析的准确度与精密度均符合定量分析的要求。2017年,Daminato B等[31]建立了一种快速、简便的检测棉籽粕中棉酚含量的方法,基于流动注射分析系统,在660 nm下进行分光光度检测,实现了对棉籽粕固体样品的直接分析。紫外分光光度法对样品纯度要求高,待测样品中含有杂质或检测基质复杂的样品时会产生较大的偏差,灵敏度不高。

3 色谱分析法

色谱分析法是利用物质的物理性质进行分离和分析的检测方法,被广泛应用于环境、材料、食品等各个科学领域,用于多组分复杂混合物的分离分析,具有速度快、效率高、选择性高和应用范围广的特点。用于检测农产品中棉酚含量的色谱分析法主要有高效薄层色谱法、高效液相色谱法和超高效液相色谱串联质谱法三种。

3.1 高效薄层色谱法

高效薄层色谱法与普通薄层色谱法相比具有分辨效率高、分析时间短和检出灵敏度高的优点,因操作简单方便被应用于许多物质的检测。沈静等[32]用高效薄层色谱法测定棉籽油中游离棉酚含量,结果表明棉酚对照品溶液在8～128 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均回收率为91.5%～100.2%。结果表明薄层扫描法测定棉籽油中游离棉酚含量,方法准确、简单、可行。此方法具有使用方便、快速、再现性好等优点,但是对生物高分子分离效果不好,结果准确可靠但精确度不高,难以实现痕量棉酚的检测。

3.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)是在气相色谱和经典液相色谱的基础上发展起来的,液相色谱分离系统由固定相和流动相组成。HPLC具有高选择性、灵敏度高、分析速度快、重复性好、应用范围广等优点,已成为现代分析技术的重要手段之一。李东雨等[33]HPLC内标法检测牛乳中游离棉酚的方法,以甘草次酸为内标物,检出限为4 μg/kg,RSD小于2%,平均加标回收率为102.3%～103.0%,该实验对乌鲁木齐市各散装牛乳点样品进行检测,未检出游离棉酚。宣岩芳等[34]用HPLC法检测鸡蛋中游离棉酚和总棉酚的含量,在0.1～50.0 μg/mL范围内线性关系良好,加标回收率为89.6%～91.7%,相对标准偏差为1.10%～4.06%(n=6),检出限为200 μg/kg,定量限为500 μg/kg。Karishma R等[35]使用HPLC对不同棉花品种棉籽中棉酚含量进行测定,并成功检测出棉籽中游离棉酚和总棉酚的含量。姚军等[36]建立了家兔血浆中棉酚的HPLC测定方法,平均加标回收率为95.7%～96.3%,检出限为200 μg/kg,采用丙酮-乙腈-正庚烷-磷酸盐溶液提取家兔血浆中游离棉酚,为生物体内棉酚的测定提供了可靠的分析方法。虽然HPLC的分析成本较高,但是它可以通过优化流动相的组成实现多组分分析物的分离,并实现对痕量棉酚的检测,仪器的灵敏度、精密度均高于高效薄层色谱法。

3.3 液相色谱-串联质谱法

以超高效液相色谱(UPLC)、高效液相色谱(HPLC)或液相色谱(LC)作为分离系统,串联质谱(MS/MS)作为检测系统的液相色谱和质谱联用技术在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。液相色谱和质谱联用技术利用色谱对复杂样品的高分离能力,与质谱或光学仪器的高选择性、高灵敏度的特点,将分离技术与目标物分子结构信息相结合的方式成功地应用于痕量棉酚的定性、定量分析工作中。Zhang W[37]等用高效液相色谱串联质谱HPLC-MS/MS外标法定量检测食用油中棉酚含量,定量限为100 μg/kg,加标回收率为87.4%～100%,稳定性高,相对标准偏差为3.9%～12.2%,实验结果准确可靠,稳定性好。袁洁等[38]等用LC-MS/MS法测鸡肝中棉酚旋光异构体,线性范围为0.1603～8.015 μg/mL,检出限为1.2 μg/kg,回收率在80.1%～115.0%之间,相对标准偏差小于11%,验证了此方法的高灵敏度和精密度。施琦贻[39]建立了HPLC-ESI-MS/MS技术检测鲜蛋黄中的棉酚残留,线性范围为1～100 ng/mL,加标回收率在85%～100%之间,对标准偏差(n=6)小于10%,精密度相对较好。姚军等[40]建立了高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS)检测棉籽仁中左旋和右旋棉酚含量的方法,以(R)-(-)-2-胺基-1-丙醇为手性拆分试剂进行柱前衍生化反应,左旋和右旋棉酚的检出限分别为2.52、3.41 μg/kg,平均加标回收率为99.4%～103.0%。LC-MS/MS检测方法具有灵敏度高,分析时间短的优点,但是仪器价格和日常维护费用昂贵,分析成本较高,限制了此方法检测农产品中棉酚含量的推广使用。

3.4 高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳法(HPCE)是依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法。郭玉娟等[41]建立了高效毛细管电泳法检测棉籽油中游离棉酚含量的方法,线性范围为10～100 μg/mL,平均回收率为99.4%～100.2%,精密度RSD为1.2%,检出限为1000 μg/kg。该方法精密度较好、检出限低、准确度高,适用于棉籽油中游离棉酚含量的检测。

4 分子印迹技术

分子印迹技术作为一种新的分析检测技术,可以满足快速检测的要求,且灵敏性高、成本低,具有预定性、特异识别性和广泛实用性的特点。2014年,赵晨等[42]设计了具有PMAA/SiO2结构的表面分子印迹聚合物来检测棉酚,使用色谱分析的方法对制备的印PMAA/SiO2迹聚合物的容量因子进行了检测,并与高效液相色谱串联紫外检测器(HPLC-UV)的容量因子进行了比较,得出MIP-PMAA/SiO2对棉酚检测的效果要优于HPLC-UV。为了减小棉酚的检测周期,降低检测成本,Chen Z等[3]提出了一种新型压电分子印迹传感器,对棉酚和其相似物进行检测,最低检测限6 μg/kg,结果表明压电型分子印迹传感器具有的特异性和灵敏性。分子印迹技术检测成本低,检出限低,使用压电型分子印迹传感器是极具潜力的测定农产品中棉酚含量的方法。

5 结论与展望

综上所述,本文从电化学分析技术、光谱分析技术、色谱技术、分子印迹技术等方面阐述了定量分析农产品中棉酚含量的检测技术及特点,并对部分检测方法的检出限进行比较,见表1。由表1可知,高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱技术的检出限相对较低,检测样品的样品基质不同也可能对结果有一定影响,高效液相色谱和高效液相色谱串联质谱技术检出限低、精密度高,联合分子印迹技术的压电型分子印迹传感器检测棉酚的成本低较。上世纪80年代有人尝试使用电化学分析法检测棉酚,这种方法的检测结果与现在先进检测技术的检测结果相比并不理想,但目前电子技术发展迅速,这可能为研究出用于检测农产品中棉酚的最佳电子技术提供参考。

表1 不同检测方法检测棉酚的检出限Table 1 Detection limit of gossypol by different detection methods

农产品中棉酚的检测技术发展较快,应根据农产品样品的本质属性与实验条件,选择较为合适的检测方法对毒性棉酚进行提取与测定。未来可以将新型前处理技术应用到复杂基质的农产品的样品中,例如石墨烯吸附法、QuEChERS提取法、悬浮固化微萃取等低填料、低溶剂量的前处理方法等,并结合快速、高效、准确的检测技术,以实现对痕量棉酚的检测。近年来,随着科技的进步与创新,农产品中棉酚的检测技术也在不断更新,试剂盒也已成为快速检验化合物的生物学方法,为棉酚的快速检测方法提供了新方向。因此,建立更加准确、高效、绿色的分析方法仍然是农产品中棉酚含量检测领域的一个重要发展趋势。