19份茶树资源鲜叶中咖啡碱合成酶的活性

段学艺，高秀兵，曹 雨，赵华富，张 圆，何 萍，胡华健(贵州省茶叶研究所，贵州 贵阳 550006)

【研究意义】咖啡碱(1，3，7-三甲基黄嘌呤)是茶叶中嘌呤碱的主体成分[1]，约占茶叶干物质的2 %～5 %[2]。茶叶咖啡碱具有兴奋中枢神经，改良心脏机能，提神、醒脑，提高思维效率，增强肝代谢功能等作用，同时还有利尿、分解脂肪的功效[3-6]。但是过量摄入咖啡碱，会导致高血压、心率不齐[7-8]，引起钙流失、骨质疏松[9-10]和流产[11-12]等不良反应。鉴于茶叶消费的广泛性和咖啡碱药理作用的复杂性，GB 2760-2014规定可乐饮料中咖啡碱最高限量≤150 mg/kg[13]，美国食品药品监督管理局(FDA)规定可乐等饮料中咖啡碱≤200 mg/mL[14]。因此，选育低咖啡碱茶树新品种具有重要的现实意义。【前人研究进展】自20世纪80年代开始，国内外一直在进行茶叶脱除咖啡碱的研究工作，主要有萃取法、超临界CO2提取、热水浸提法和色谱吸附法等方法[15-18]。但是有关脱除茶叶咖啡碱的系统研究和有效方法较少。【本研究切入点】要从根本上降低茶叶咖啡碱，还是要从茶树育种和栽培学等研究途径着手，通过常规的茶树育种方法筛选低咖啡碱茶树新品种[19-22]。【拟解决的关键问题】选取贵州3种古茶树资源与16个选育茶树品种，提取茶树嫩叶的咖啡碱合成酶[23]；体外进行咖啡碱合成的酶促反应[24]，HPLC测定反应后各体系咖啡碱的含量[25]，比较19份茶树资源的咖啡碱合成酶(TCS)活性，以筛选出咖啡碱合成酶活性低的茶树资源，为选育低咖啡碱茶树新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 茶树资源

19份茶树资源分别为龙井长叶、龙井、保靖黄金茶、乌牛早、丹桂、盘县大茶树、浙农、黄金叶、福鼎大白茶、黔湄601、黄金芽、七舍大茶树、金观音、铁观音、中茶108、晴隆大茶树、香山早、安吉白茶和梅占，其嫩叶均采摘自贵州省茶叶研究所的种质资源圃。

1.2 咖啡碱合成酶的提取

将新鲜茶树嫩叶剪成小片，并立即放入-20 ℃冰箱冷冻1 h。将冷冻嫩叶样品2 g、聚乙烯吡咯烷酮1.2 g、石英砂0.6 g、100 mmol/L磷酸钾盐缓冲液(pH 7.3，含有5 mmol/L巯基乙醇，5 mmol/L EDTA，0.5 %抗坏血酸钠)10 mL一起加入已冷冻的研钵中进行匀浆。匀浆经4层纱布过滤后离心(重力加速度为10 000 g，下同)20 min收集上清液，加入固体硫酸铵将上清液调至20 %(W/V)的饱和度，搅拌20 min后离心15 min继续收集上层清液，再加入固体硫酸铵将上清液调至60 %(W/V)的饱和度，搅拌20 min后离心15 min弃上清液，将沉淀溶于上述磷酸盐缓冲液中。最后将获得的蛋白溶液进行凝胶层析(葡聚糖凝胶G-25，层析柱规格为30 cm×2 cm)，洗脱剂为10 mmol/L磷酸钾盐缓冲液(pH 7.3，含有10 mmol/L巯基乙醇，2 mmol/L EDTA)。以上所有步骤均在4 ℃条件下进行。收集到的活性成分即为咖啡碱合成酶粗酶液，各取最先洗脱出的粗酶液1.5 mL，-20 ℃保存备用，一般在2周内酶活力下降不显著。

1.3 咖啡碱合成酶的体外酶促反应及活性检测

取400 μl咖啡碱合成酶粗酶液进行体外酶促反应，反应体系：咖啡碱合成酶粗酶液400 μl，1 μmol底物可可碱(theobromine)200 μl，1 μmol甲基供体S-腺苷蛋氨酸(S-adenosy-lL-metionine)50 μl。37 ℃反应30 min后加入100 μl浓度为6 mol的HCl终止反应。

高效液相检测，色谱柱为Syncronis C18(4.6 mm×250 mm，5 μmol)；流动相为乙腈-水，等度洗脱，洗脱比例为12︰88，检测波长272 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量均为20 μl。

反应产物用HPLC法进行检测，取配制浓度为14.12 μg/mL的咖啡碱对照品溶液1、0.5、0.1 μl，进行高效液相检测，制作咖啡碱标准曲线，对反应产物进行定量。称取咖啡碱标准物质(批号：A20N6L6274，含量≥99 %)3.53 mg放入5 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容作为储备液，再取0.5 mL储备液置于25 mL容量瓶，用甲醇定容，得到14.12 μg/mL 咖啡碱对照品溶液。

图1 咖啡碱标准曲线Fig.1 The standard curve of caffeine

2 结果与分析

2.1 咖啡碱标准曲线

从图1看出，咖啡碱进样质量(x)与峰面积(y)的线性方程为y=3621.8x+1.8672，R2=1，表明其线性关系良好。

2.2 19份茶树资源嫩叶中咖啡碱的含量

从表1看出，七舍大茶树在体外酶促反应终止后咖啡碱含量最高，为0.900 μg/mL；其次是保靖黄金茶，为0.376 μg/mL；第三是黄金叶，为0.210 μg/mL；乌牛早、晴隆大茶树、龙井茶叶等15份茶树资源的咖啡碱含量为0.101～0.164 μg/mL，差异不明显；最低是盘县大茶树，为0.089 μg/mL。

2.3 19份茶树资源嫩叶中咖啡碱合成酶的活性

从表2看出，七舍大茶树嫩叶的咖啡碱合成酶活性最高，为0.386 U/mL；其次是保靖黄金茶，为0.161 U/mL；黄金叶、乌牛早分别为0.090和0.070 U/mL；晴隆大茶树、龙井长叶、浙浓为0.043～0.067 U/mL，差异较小；盘县大茶树最低，仅0.038 U/mL。

3 讨 论

茶叶中咖啡碱的含量与茶树种质资源特性有关，同时也与所处的自然环境和自身生长期有关。不同品种茶叶中咖啡碱的含量差异很大；同一茶树鲜叶中咖啡碱的合成较多，也是整个茶叶咖啡碱的主要来源。目前，关于不同气候对茶叶咖啡碱合成酶活性影响的研究较少，缺乏低咖啡碱茶树资源适生分布区的调研，阻碍了低咖啡碱茶树品种选育的进程。

表1 茶树资源嫩叶中咖啡碱合成酶体外酶促反应终止后HPLC检测结果Table 1 Caffeine content in tender leaves of 19 tea germplasm resources detected by HPLC after in-vitro enzymatic reaction end of caffeine synthase

表2 茶树资源嫩叶中咖啡碱合成酶的酶活Table 2 Caffeine synthase activity in tender leaves of 19 tea germplasm resources

如何有效降低茶叶中咖啡碱含量一直是茶叶研究的热点。目前，多采用理化方法在茶叶加工阶段进行咖啡碱的萃取、吸附、浸提等。虽然理化方法应用较早，但不能解决根本问题，且成本较高，不能有效保留茶叶中的香气和滋味。利用基因工程对茶树资源进行改造，沉默咖啡碱合成酶中关键酶的基因，即抑制咖啡碱合成酶以及S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的表达，可降低茶叶中咖啡碱的含量。但是该法过程复杂、操作难度高，经济投入大，且降低咖啡碱的效果也不太理想。常规的茶树育种或杂交方法筛选低咖啡碱茶树新品种能有效降低茶叶的咖啡碱，是从本质上降低咖啡碱的方法。但是该法选育低咖啡碱茶树品种至少需要20 a左右，要耗费大量的人力、物力和财力，且选育出的茶树品种往往存在综合性状不良的缺点。通过收集低咖啡碱茶树种质资源，发掘品质优良的茶树资源，再利用基因工程改造技术缩短茶树品种选育时间，高效率达到茶叶品质优良与低咖啡碱的目的。

在龙井长叶、龙井、保靖黄金茶等19份茶树资源中，采自贵州的3份大茶树资源(七舍大茶树、晴隆大茶树、盘县大茶树)鲜叶的咖啡碱合成酶活性差异较大，可能主要与各茶树的种质资源特异性有关，或与各自所处的气候环境息息相关；其余常见16份茶树品种鲜叶的咖啡碱合成酶活性差异不大，在0.05 U/mL左右。

4 结 论

研究结果表明，在龙井长叶、龙井、保靖黄金茶等19份茶树资源中，龙井长叶等其余15种的活性差异不大，在0.043～0.07 U/mL；七舍古茶的咖啡碱合成酶活性最高，为0.386 U/mL；其次是保靖黄金茶、黄金叶，分别为0.161和0.090 U/mL；盘县古茶的咖啡碱合成酶活性最低，为0.038 U/mL。因此，盘县古茶树可作为低咖啡碱新品种的选育材料。

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