大孔吸附树脂富集速溶茶中咖啡碱的研究

杨军国，吴 劼，陈宏坤，陈 林*

(1.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015；2.大闽国际集团研发中心，福建 漳州 363000)

大孔吸附树脂富集速溶茶中咖啡碱的研究

杨军国1，吴 劼2，陈宏坤2，陈 林1*

(1.福建省农业科学院茶叶研究所，福建 福安 355015；2.大闽国际集团研发中心，福建 漳州 363000)

能量饮料市场发展迅速，进一步推动了咖啡碱的市场需求。LX-16脂吸附分离酯型儿茶素后，过柱液中含有大量的咖啡碱，从而作为原料研究采用大孔吸附树脂富集咖啡碱的工艺。通过比较4种大孔吸附树脂对咖啡碱的吸附能力，筛选出最佳树脂LS-303，并考察其动态吸附与乙醇梯度洗脱等特性。结果表明，LS-303树脂吸附饱和后，20%乙醇解吸，洗脱3BV后咖啡碱解吸得率为93.17%，咖啡碱含量可达26.16%。

速溶茶；咖啡碱；大孔吸附树脂

速溶茶因其卫生、营养、方便等特点，愈来愈受到国内外消费者的青睐。基于社会的保健需求和功能性饮料的日益细分，高功能成分含量的速溶茶成为了进一步的发展趋势[1]。咖啡碱(Caffeine)，又名茶素或咖啡因，是茶叶中含量最高的生物碱，具有兴奋中枢神经、增加人体免疫力、强心利尿等作用[2-3]，在食品(主要是饮料行业)和医药保健品行业得到了广泛的应用。尤其是，近年来含有咖啡碱成分的能量饮料市场发展迅速，进一步推动了咖啡碱的市场需求。因此，开发高咖啡碱含量的速溶茶，在速溶茶产业发展及应用方面具有十分重要的意义。

从茶叶中提取制备咖啡碱的传统方法主要有溶剂萃取法、升华法和离子沉淀法等[4-6]，但由于溶剂残留，溶解性不佳等问题致使上述工艺制备的咖啡碱不能用于普通饮料。近年来，一些新型提取技术应用于茶叶中咖啡碱的脱除或萃取研究，如超声波[7-8]、微波[8-10]、膜分离[11]、吸附树脂法[12-14]、超临界萃取[15-16]等方法，然而仍具有成本高、得率低、安全性等问题。因此，研究开发咖啡碱与其他茶叶功效成分的综合提取分离，且工艺绿色环保，具有很好的市场前景和价值。大孔吸附树脂技术，利用其对不同成分的选择性吸附及筛选作用分离纯化植物的天然成分，具有能耗低、易再生、无环境污染等优点，现已广泛应用于环境保护、合成化学及生物医药等领域。以速溶茶粉为原料，前期研究发现经LX-16大孔吸附树脂吸附分离后，过柱液中含有大量的咖啡碱及简单儿茶素[17]。因此，本文开展大孔树脂吸附法富集速溶茶中咖啡碱的研究，进一步提高产品附加值，为高咖啡碱速溶茶的制备提供了一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

试验材料：SG76速溶茶粉为大闽食品(漳州)有限公司提供；各儿茶素标准样(表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、表儿茶素没食子酸酯ECG、表儿茶素EC、儿茶素C、表没食子儿茶素EGC、Caffeine纯度≥98%)中国药品生物制品检定所提供；大孔吸附树脂样品LS-303系陕西蓝深特种树脂有限公司提供，DM-2系天津市海光化工有限公司提供；LX-17系西安蓝晓科技有限公司；D4020系山东鲁抗股份有限公司树脂分厂；液相用试剂均为色谱纯，其余用到试剂皆为分析纯。

试验仪器和设备：循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ)上海申生科技有限公司；双功能水浴恒温振荡器(SHA-B)杰瑞尔电器有限公司；高效液相色谱(2795)美国Waters公司；色谱柱(5u Pheny1-Hexy1)广州菲罗门科学仪器有限公司；真空冷冻干燥机(LGJ-30F)武汉世纪超杰实验仪器有限公司；玻璃层析柱(3.5×50 cm)砂芯玻璃仪器有限公司；冷冻离心机(Allegra 64R)美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 儿茶素及咖啡碱分析条件

参照GB/T21727-2008国标法测定儿茶素、咖啡碱。

1.3 大孔吸附树脂的预处理

用95%乙醇溶液浸泡大孔吸附树脂24 h，使其充分溶胀。湿法装柱于玻璃层析柱中，用95%乙醇淋洗，待洗出液不浑浊时改用重蒸水淋洗，洗至无明显乙醇气味即可(此时乙醇浓度低于5%)。

1.4 LX-16树脂对咖啡碱的吸附效果

准确称取LX-16树脂500 g(湿重)，湿法装柱。配制浓度为25 mg·mL-1的SG76茶粉溶液3000 mL，以1 BV·h-1的吸附流速上柱吸附，分别收集过柱液1 BV、2 BV、2 BV-0、3 BV、3 BV-0、4 BV、4 BV-0、5-6 BV，检测过柱液中咖啡碱含量。此处，1 BV等同于树脂体积，即500 mL；2 BV-0意为收集达到2 BV过柱液时的取样液。

1.5 大孔吸附树脂筛选

准确量取4种大孔吸附树脂LS-303、DM-2、LX-17和D4020各10 mL(湿重体积)于250 mL锥形瓶中，加入100 mL茶粉质量浓度为15 mg·mL-1的SG76茶粉溶液，于室温震荡吸附24 h，测定溶液中咖啡碱浓度；吸附结束后收集水相与水洗2遍后的水洗液合并在一起，测量体积定为V，用滤纸吸干树脂表面液体后将其置于锥形瓶中加入95%乙醇溶液50 mL，于室温震荡解吸24 h，测定解吸液中咖啡碱的质量浓度，并计算树脂的吸附量和解吸率，筛选出目的树脂。

吸附量(mg·mL-1)=(茶粉溶液中咖啡碱含量×100 mL-收集液中咖啡碱含量×V)/10 mL

解吸率(%)=解吸液中咖啡碱含量×50 mL/(茶粉溶液中咖啡碱含量×100 mL-收集液中咖啡碱含量×V)×100%

其中，式中V为树脂吸附结束后水相及水洗液合并的总体积。

1.6 大孔吸附树脂对儿茶素和咖啡碱的分离研究

准确称取4种大孔吸附树脂LS-303、DM-2、LX-17和D4020各200 g(湿重)，湿法装柱。软化水配制浓度50 mg·mL-1的SG76绿茶粉溶液，以1 BV·h-1吸附流速上柱吸附饱和后，分别以10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇按照2 BV·h-1洗脱流速各洗脱2 BV，分别收集洗脱液检测EGC、咖啡碱和EGCG的含量。

1.7 大孔吸附树脂对咖啡碱的吸附研究

准确称取200 g(湿重)的吸附树脂，湿法装柱。取LX-16树脂过柱液2400 mL，以1 BV·h-1的吸附流速上柱，过柱液按每1 BV分段收集后进行HPLC检测。该树脂吸附饱和后，进行工艺参数优化实验。选择不同浓度乙醇5%、10%、20%和30%作为洗脱剂，按2 BV·h-1洗脱流速各洗脱得到2 BV，检测分析洗脱液中咖啡碱含量及解吸得率筛选出最佳洗脱剂浓度。以最佳浓度的洗脱剂按2 BV·h-1流速解吸吸附饱和咖啡碱的吸附树脂，分段收集得到1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV，检测分析其咖啡碱含量及解吸得率，筛选出最佳洗脱体积。

2 结果与分析

2.1 LX-16树脂对咖啡碱的吸附效果

前期研究表明，LX-16大孔吸附树脂对酯型儿茶素具有良好的吸附选择性，通过梯度洗脱，酯型儿茶素产品纯度可从7.3%提高到65.2%[17]。研究还发现，该吸附树脂对咖啡碱低吸附，即过柱液中有高含量的咖啡碱物质。试验配制浓度25 mg·mL-1的SG76茶粉溶液(咖啡碱含量为1210 μg·mL-1)，上LX-16柱吸附，收集不同体积过柱液以考察LX-16大孔吸附树脂对咖啡碱的吸附作用，结果见图1。结果发现，第1 BV的过柱液咖啡碱含量为208.17 μg·mL-1，表明第1个BV该LX-16树脂对咖啡碱的吸附量较大，吸附率在80%以上。从第2个BV开始，咖啡碱的吸附量骤降，吸附率低至约40%。而从第2 BV临界点取样检测看，咖啡碱含量为928.18 μg·mL-1，吸附率为23%。从第3个BV开始，LX-16树脂对咖啡碱的吸附量及吸附率基本稳定，吸附率约在20%。本次试验表明，LX-16树脂在吸附第1 BV后，咖啡碱已经出现穿透，穿透率在20%，第2个BV平均穿透率在60%，第2 BV后段穿透率在80%，第3 BV以后开始维持在咖啡碱穿透率80%，揭示该大孔吸附树脂对咖啡碱低吸附量及过柱液中含有大量的咖啡碱物质。由此，在LX-16富集制备高酯型儿茶素茶粉的基础上，可从其过柱液中吸附分离制备高咖啡碱含量的速溶茶粉，从而提高产品的附加值。

图1 LX-16大孔吸附树脂对茶粉溶液中咖啡碱的吸附效果Fig.1 Effect of macroporous resin, LX-16, on caffeine adsorption from tea solution

2.2 大孔吸附树脂对咖啡碱的吸附作用

试验选择了4种不同性质的大孔吸附树脂进行分离比较，不同树脂对咖啡碱的静态吸附量与解吸率见表1。从静态吸附量及解吸率上来看，LS-303树脂效果最好，对咖啡碱吸附量达62.35 mg·g-1，而其余三款大孔树脂吸附量相对较低，且LS-303的解吸率也最高。本组试验数据表明，LS-303树脂为较理想的可用于吸附咖啡碱的大孔吸附树脂。

表1 4种大孔吸附树脂对咖啡碱静态吸附和解吸能力的比较

注：同一列数据后不同的字母表示经过LSD检验在5%水平上差异显著性，下同。

通过梯度浓度洗脱试验，进一步的综合性评价所选4种大孔吸附树脂对咖啡碱与儿茶素的吸附分离效果，结果见表2。从解吸得到的咖啡碱含量来看，LS-303树脂吸附量最高，依次为DM-2、D4020、LX-17，这与表1的结果一致；从吸附专一性来看，D4020效果最好，表现出较好的专一吸附咖啡碱，LS-303效果其次，LX-17和DM-2对咖啡碱和儿茶素都具有高吸附；从解吸附效果来看，LS-303树脂用30%乙醇解吸，咖啡碱基本解吸完全，D4020树脂则10%乙醇就已经体现出较好的解吸效果。相对应的，DM-2的50%乙醇解吸液中还含有较高含量的咖啡碱，说明要完全解吸咖啡碱需要更高浓度的乙醇。综合来看，D4020树脂虽然吸附咖啡碱效果专一，且易解吸，但是其吸附量较低； LS-303树脂高吸附咖啡碱，且易解吸，吸附专一性较强，体现出较好的优势；DM-2树脂相对来说，解吸咖啡碱乙醇浓度稍高，且对EGCG高吸附，故不予选择；LX-17体现出广谱性，对儿茶素及咖啡碱都有吸附，也不予选择。本次试验数据表明，LS-303树脂为吸附富集咖啡碱的最佳类型树脂。

2.3 LS-303树脂对LX-16过柱液的吸附效果

LX-16过柱液中含有大量的咖啡碱。对其过柱液理化检测结果为EGC 2.839 mg·mL-1，咖啡碱3.425 mg·mL-1，EC 0.93 mg·mL-1，EGCG 0.422 mg·mL-1，表明LX-16过柱液中不仅含有大量的咖啡碱，还有简单儿茶素EGC。

图2为LS-303树脂吸附后过柱液中咖啡碱及EGC的含量变化。结果表明，在1 BV～7 BV的过柱液体积内，LS-303树脂的过柱液中没有检测到咖啡碱，表明咖啡碱完全被吸附。过柱液第8个BV时检测到咖啡碱，含量为106.93 μg·mL-1，穿透率为3.12%，第9个BV时咖啡碱含量为283.78 μg·mL-1，穿透率为8.28%。从结果还可以看出，在12个BV时咖啡碱的穿透率为36.31%，说明LS-303树脂还在吸附一定量的咖啡碱，但由于出现咖啡碱大量穿透，生产时不予考虑。同时，LX-16树脂过柱液中还有高含量的简单儿茶素EGC。从结果来看，LS-303过柱液只有第1个BV没有检测到EGC含量，至第2个BV时检测EGC含量为52.48 μg·mL-1，穿透率为1.85%；第3个BV时EGC含量为212.17 μg·mL-1，穿透率为7.47%；第4 BV～6 BV检测数据表明，EGC含量依次递增，穿透率由31.09%增加到85.15%；从第8 BV～12 BV，EGC含量基本稳定，穿透率维持在90%左右。如此来看，LS-303树脂对简单儿茶素EGC吸附量较低。因此，LS-303树脂高吸附咖啡碱，低吸附简单儿茶素EGC，表明该树脂可用于富集制备LX-16过柱液中的咖啡碱物质，同时一定程度上分离EGC和咖啡碱。

注：“N/A”表示未检测到该物质。

2.4 洗脱液浓度优化

LS-303树脂吸附咖啡碱后，选择不同浓度的乙醇(5%、10%、20%、30%)洗脱2 BV，检测咖啡碱含量并计算其得率。结果见表3，5%乙醇洗脱液中咖啡碱含量3.37 mg·mL-1，计算其得率为24.60%，10%乙醇洗脱液中咖啡碱含量3.88 mg·mL-1，计算其得率28.32%，20%乙醇洗脱液中咖啡碱含量4.40 mg·mL-1，计算其得率32.12%，而30%乙醇洗脱液中咖啡碱含量较少。从结果来看，5%乙醇已可将咖啡碱解吸出来，但得率偏低，20%乙醇对咖啡碱的解吸效果最好，得率也最高为32.12%(在5%和10%乙醇各洗脱2 BV的基础上)，而30%乙醇洗脱液中咖啡碱含量及得率都较低，表明20%乙醇时已可将咖啡碱解吸。综合成本与得率，选取20%乙醇为解吸咖啡碱的最佳浓度。

图2 LS-303大孔吸附树脂过柱液中咖啡碱和EGC的含量变化Fig.2 Contents of caffeine and EGC in tea solution after adsorption by LS-303

表3 不同浓度的乙醇对LS-303树脂吸附咖啡碱后的解吸效果

2.5 洗脱体积参数优化

依据上述试验表明，LS-303树脂吸附咖啡碱后20%乙醇可解吸附。本次试验在LS-303吸附饱和后，用20%乙醇洗脱树脂，收集1 BV～6 BV，检测咖啡碱含量，从而实现该树脂的洗脱体积参数优化。结果见表4，第1 BV洗脱液中咖啡碱含量14.63 mg·mL-1，第2 BV洗脱液中咖啡碱含量为9.33 mg·mL-1，第3 BV洗脱液中咖啡碱含量1.56 mg·mL-1，第4 BV～6 BV洗脱液中可忽略不计。从咖啡碱得率来看，第1 BV咖啡碱得率为53.41%，第2 BV咖啡碱得率34.07%，第3 BV咖啡碱得率5.69%，第4 BV～6 BV咖啡碱得率累计为1.92%，可不计。综合来看，前3个BV洗脱液中咖啡碱含量较高，尤以第1 BV洗脱液中咖啡碱含量最高，总计得率为93.17%。因此，综合成本与得率洗脱体积3 BV为佳。

表4 不同洗脱体积中咖啡碱含量及得率

注：“N/A”表示未检测到该物质。

3 结论与讨论

基于社会的保健需求和功能型饮料的日益细分，功能型速溶茶成为必然的发展趋势，要求市场出现高茶多酚速溶茶、高儿茶素速溶茶、高茶多糖速溶茶、高茶氨酸速溶茶、高茶黄素速溶茶、高γ-氨基丁酸速溶茶、高咖啡碱速溶茶等[1]。前期研究发现，LX-16大孔吸附树脂吸附分离酯型儿茶素后，过柱液中含有大量的咖啡碱和简单儿茶素EGC，从而为综合开发制备高咖啡碱速溶茶奠定了基础。试验选择了4种不同性质的大孔吸附树脂对咖啡碱的吸附作用进行了筛选，优选得到LS-303大孔吸附树脂吸。结果表明，LS-303树脂吸附饱和后，20%乙醇解吸，洗脱3 BV，咖啡碱解吸得率达到93.17%。该咖啡碱洗脱液经浓缩回收乙醇后，喷干制得高咖啡碱速溶茶粉。感官分析表明，呈绿黄色粉末、香气纯正、滋味醇和，常温水可溶解，理化检测分析表明咖啡碱含量达到26.16%。大孔吸附树脂技术具有能耗低、易再生、无环境污染、易实现工业化生产等优点，可广泛应用于食品工业和医药保健领域，市场发展前景广阔。

茶叶中含有约2%～4%的咖啡碱，单独提取制备具有相当大的难度，与其他茶叶功效成分的综合提取分离可视为行之有效的手段。张效林等[18]通过对树脂吸附性能、脱附性能的试验研究，确定了用PA树脂和XDA大孔吸附树脂二级吸附法生产茶多酚和咖啡碱的新工艺。本试验以速溶茶粉为原料，结合两级大孔吸附树脂可实现速溶茶粉的功能成分的进一步综合富集分离(见图3)，LX-16树脂可吸附分离制得高酯型儿茶素速溶茶粉，其过柱液中含有大量的咖啡碱及简单儿茶素EGC(图1)，进一步通过LS-303树脂吸附分离制得高咖啡碱速溶茶，LS-303过柱液中含有简单儿茶素EGC(图2)，浓缩回收喷雾干燥可制得高简单儿茶素速溶茶粉。结合前期的研究工作，本研究通过两级大孔吸附树脂可实现高酯型儿茶素速溶茶粉、高咖啡碱速溶茶粉和高简单儿茶素速溶茶粉的综合分离制备，该工艺避免使用有毒的有机溶剂、工艺简单、能耗低、成本小，易实现规模化生产。

图3 高功能成分速溶茶的综合制备工艺流程Fig.3 Flow chart of processing instant tea powder with high contents of functional ingredients

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ApplicationofMacroporousAdsorptionResinforEnrichingCaffeineContentinInstantTeaProducts

YANG Jun-guo1, WU Jie2, CHEN Hong-kun2, CHEN Lin1*

(1.TeaResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalScience,Fu’an,Fujian355015,China;2.ResearchandDevelopmentCenter,DaminInternationalGroup,Zhangzhou,Fujian363000,China)

As the market for energy drinks grows rapidly, the demand of caffeine has escalated. In extracting ester catechins from tea with adsorption resins, such as LX-16, a high content of caffeine is normally found in the effluent. To recover the caffeine for use as a functional ingredient, an experiment was conducted using macroporous adsorption resins. Through tests comparing the adsorption capacities of 4 resins, LS-303 was selected. Subsequently, the functionalities, including the desorption capacity, dynamic adsorption and alcohol gradient elution, of an LS-303 filtration system were evaluated and the process optimized. As a result, after desorption by using 3 BV of 20% alcohol as the eluent, a caffeine recovery rate at 93.17% from the tea solution was achieved. With the enrichment, the caffeine content in the instant tea powder could reach 26.16%.

instant tea powder; caffeine; macroporous adsorption resin

TS201.1

A

2096-0220(2017)03-0139-06

2017-07-21初稿；2017-08-10修改稿

福建省自然科学基金项目(2015J05057)；福建省农业科学院“青年科技英才百人计划”项目(YC2015-8)；福建省农业科学院茶叶研究所重点项目(2014-cys-03)；福建省属公益类科研院所科研基本专项(2015R1012-5)。

杨军国，(1980-)，男，博士，助理研究员，主要从事茶叶生物化学与综合利用研究。E-mail：95711139@qq.com

*通讯作者：陈林(1975-)，男，博士，副研究员，主要从事茶叶加工、茶叶生物化学与综合利用研究。E-mail：82785676@qq.com