日本血吸虫阳性钉螺和阴性钉螺组织切片对比分析

袁飞洲，舒凡帆，吴杰，李朝，石莲琴，邹丰才，杨建发*

（1西双版纳傣族自治州动物疫病预防控制中心，云南 西双版纳 666100；2大理大学农学与生物科学学院，云南 大理 671003；3云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

日本血吸虫（Schistosoma japonicum）是一种危害严重的人畜共患寄生虫，钉螺作为日本血吸虫病唯一的中间宿主，对该病的流行传播发挥媒介作用，因此，消灭钉螺是控制血吸虫病主要的措施[1-2]。钉螺的外壳为右螺旋状的圆锥形，去壳后为软体组织，软体组织前部主要包括头、颈和足，以及外套膜，后面是内脏囊，内脏囊含有各个脏器。肝包括消化腺和性腺，消化腺是橘黄色的大型腺体，与性腺共同占据了大部分内脏囊。研究表明[3]：由于壳和内脏囊之间有距离，已感染日本血吸虫钉螺的这个微小距离，可被虫体寄生导致消化腺肿大的挤压而消失，同时，病理情况下钉螺肝脏肿大，呈淡棕色或灰白色，表面有许多大小不等、排列不齐的白斑，周围为被挤压的褐色肝实质细胞。而钉螺肌纤维正常是呈长纺锤形的平滑肌纤维，核位于细胞中央[4]。

目前关于寄生虫与宿主之间互作的病理组织切片的报道较少，钉螺相关的仅见有钉螺头部神经节病理切片[5]、日本血吸虫毛蚴在钉螺体内发育组织切片[6]。刘韬等[7]把感染斯氏艾美尔球虫兔子的肝脏制作成组织切片，观察到该虫裂殖和配子生殖时期的虫体；王时伟等[8]对感染柔嫩艾美尔球虫的鸡盲肠组织制作成病理切片，观察发现盲肠肠绒毛上皮和肠腺及肌层均有虫体寄生，并发生出血性病变；王时伟等[9]进行了堆型艾美尔球虫的分离与病理学探索，结果观察到肠绒毛断裂、脱落，在其上皮细胞中发现虫体；吕元聪等[10]把感染弓形虫的小白鼠脏器组织进行了病理组织切片的制作与观察，除脑组织未发现虫体和病变，其他组织均有虫体出现，对临床症状不明显或不足以确诊的弓形虫病，适合采集淋巴结制作成病理组织切片，以观察是否有滋养体来确诊该病。目前，日本血吸虫毛蚴进入钉螺后，在其体内进行发育过程而导致的病理变化尚未见报道。

因此，本试验通过对比分析感染日本血吸虫的阳性钉螺、阴性钉螺的肌肉和肝脏组织的病理变化，从病理学角度揭示日本血吸虫对钉螺造成的影响，以期为阳性钉螺的诊断鉴定提供病理学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 钉螺来源

江苏省血吸虫病防治研究所馈赠。

1.1.2 主要试剂

灭菌4%生理盐水，4%多聚甲醛，石蜡，无水乙醇，双蒸水，二甲苯，中性树脂等。

1.2 方法

1.2.1 钉螺的镜检

将钉螺压片，弃掉螺壳，通过镜检辨别鉴定阳性钉螺和阴性钉螺，步骤如下：

（1）用灭菌4%生理盐水清洗钉螺3遍。

（2）把钉螺放在洁净的载玻片上，用另一片载玻片压碎钉螺，用镊子弃掉螺壳，加一滴生理盐水镜检。

（3）显微镜下观察是否有日本血吸虫胞蚴或尾蚴的存在，从而确定阳性和阴性钉螺。

（4）重复上述步骤，完成10只阳性钉螺和10只阴性钉螺的检测，将冲洗干净的软体组织放入装有4%多聚甲醛的冻存管中浸泡，用于制作组织切片。

1.2.2 组织切片的制作

将新鲜的钉螺软体组织，按照以下步骤完成组织切片的制作[5]。

（1）固定：将镜检后的钉螺组织放在装有4%多聚甲醛的冻存管中，浸泡72 h，备用。

（2）冲洗：将浸泡过4%多聚甲醛的钉螺组织用纱布包裹好，放入包埋盒中，置于大烧杯里，自来水冲洗2 h。

（3）智能脱水机程序：将自来水冲洗后的钉螺肉，连同包埋盒一同放入智能脱水机中脱水、透明和浸蜡。

（4）包埋：将包埋盒从智能脱水机中取出，拿出钉螺组织，放入石蜡模具中，用生物组织自动包埋机对钉螺组织块进行包埋，冷却后切片。

（5）切片和展片：修整包埋好的钉螺组织蜡块，并固定于切片机上，先粗切，后细切，切片厚度为8 μm，将切好的切片用毛笔蘸取下来，置于温度为60℃恒温水浴锅中，展开，用多赖聚氨酸处理过的载玻片进行捞片，使切片完整且完全展开。

（6）烘片：将样本切片放入65℃烘箱中，进行烘干，过夜。

（7）HE染色并显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 钉螺镜检结果

通过对钉螺进行玻片重压法解剖，在光学显微镜下对其镜检，先用20倍镜观察是否有虫体，发现有虫体摆动尾部后，用40倍镜放大观察虫体，可确认为日本血吸虫尾蚴，如图1所示：20×光学显微镜下可见数条尾蚴由体部和尾部构成，体部呈长椭圆形，尾部具有细长尾干，尾干端部有分叉尾叶；图2所示：40×光学显微镜下可见体部前端有口孔，腹中部表面有腹吸盘，体表有许多单根纤毛的乳头状感觉器官。

图1 尾蚴（20×）Fig.1 Cercariae(20×)

图2 尾蚴（40×）Fig.2 Cercariae(40×)

2.2 阳性和阴性钉螺组织切片对比

10只阳性钉螺和10只阴性钉螺共20个蜡块样本，每个样本制作2张切片，每个样本拍摄5张照片，共40张病理组织切片，200张病理组织切片照片。通过对这些组织切片的观察，发现阳性钉螺与阴性钉螺的肌肉组织及肝脏的变化（表1）。阳性钉螺肌肉组织会出现色淡、肿胀，部分肿胀至断裂，肌纤维排列混乱等现象（图3、图4）；阴性钉螺肌肉组织则较为饱满、红润，且排列整齐（图5、图6）；阳性钉螺肝组织脆弱、易碎，出现充血和水泡样变性，大量嗜酸性粒细胞的浸润，大量淋巴细胞和少量巨噬细胞的渗出，肝腺管壁含有丰富的多角形颗粒细胞，位于肝腺管边缘（图7、图8）；阴性钉螺肝细胞胞质饱满，紧密，管壁上覆有纤毛上皮细胞，呈纵向褶皱（图 9、图 10）

表1 阳性钉螺和阴性钉螺组织切片对比Tab.1 Compared of positiveOncomelanias hupensis and negativeOncomelanias hupensistissue sections

图3 阳性钉螺肌肉组织 (HE 200×)Fig.3 Positive Oncomelania muscle tissue(HE 200×)

图4 阳性钉螺肌肉组织 (HE 400×)Fig.4 Positive Oncomelania muscle tissue(HE 400×)

图5 阴性钉螺肌肉组织 (HE 200×)Fig.5 Negative Oncomelania muscle tissue(HE 200×)

图6 阴性钉螺肌肉组织 (HE 400×)Fig.6 Negative Oncomelania muscle tissue(HE 400×)

图7 阳性钉螺肝组织 (HE 200×)Fig.7 Positive Oncomelania hepatic tissue(HE 200×)

图8 阳性钉螺肝组织 (HE 400×)Fig.8 Positive Oncomelania hepatic tissue(HE 400×)

图9 阴性钉螺肝组织 (HE 200×)Fig.9 Negative Oncomelania hepatic tissue(HE 200×)

图10 阴性钉螺肝组织 (HE 400×)Fig.10 Negative Oncomelania hepatic tissue(HE 400×)

3 讨论

日本血吸虫毛蚴入侵钉螺软体后，经过发育和无性繁殖，最后逸出尾蚴。这个过程包括毛蚴入侵、母胞蚴发育、子胞蚴发育、尾蚴成熟逸出等阶段，且有明显的移行过程。夏明仪等[11]应用组织学方法观察，发现日本血吸虫毛蚴除了入侵皮肤途径外，至少57%的毛蚴是从钉螺本身的空口钻入。舒利民[12]对钉螺感染日本血吸虫毛蚴后，采用组织学检测方法就毛蚴对钉螺的钻穿及在钉螺体内分布和移行进行了研究，发现毛蚴钻穿主要是在钉螺鳃部、头足部的表皮和实质组织。毛蚴入侵钉螺体内并完成定位的过程，也是其完成从毛蚴转变至母胞蚴的过程。母胞蚴在钉螺体内经过无性繁殖阶段产生子胞蚴，并在钉螺体内移行至消化腺，也就是最终的肝脏寄生部位。

本试验采用组织切片实验技术，对阳性钉螺和阴性钉螺组织切片进行制作与对比分析，初步获悉了日本血吸虫与钉螺互作过程中，钉螺肝脏组织与肌肉组织的病理变化。相对于阴性钉螺感染的螺肌肉，阳性钉螺肌肉出现色淡，肿胀可能是由于尾蚴发育需要吮吸钉螺血液，肌纤维肿胀断裂，排列混乱是由于尾蚴在钉螺肌肉内部进行游走移行，破坏了肌纤维结构，给钉螺带来一定损害。同时，阳性钉螺肝脏细胞出现水泡样变性，可能是由于钉螺肝脏是抗尾蚴入侵的重要部位，发生了强烈的炎症反应。阳性钉螺肝脏出现的大量白细胞，如嗜酸性粒细胞浸润，大量淋巴细胞和少量巨噬细胞也提示钉螺肝脏处发生了炎症反应。阳性钉螺组织切片中观察到嗜酸性粒细胞，引起嗜酸性粒细胞增多的感染性疾病主要为寄生虫感染[13]，且日本血吸虫对嗜酸性粒细胞有明显趋化作用[14]。而淋巴细胞增多后，具有对趋化性刺激做出直接反应的能力，通过吞噬、胞饮和细胞毒性反应等方式来排除异己，即钉螺通过内部防御系统对入侵的血吸虫幼虫进行攻击。

通过本次试验，初步获悉了阳性钉螺组织的病理变化，并且从病理学角度探索日本血吸虫与钉螺互作的影响，为阳性钉螺的诊断鉴定提供病理学方面的参考。