快速建立CBA小鼠急性耳毒性模型的研究

董玉梅，洪玉，汪朦，桂飞，宋晓明，杨怡，谌容，黄瑾，杨磊，*

（石河子大学医学院，新疆 石河子 832002；2杭州师范大学医学院，浙江 杭州 310000）

理想的耳毒性动物模型是研究听力损失及毛细胞再生的基础，不同物种对同一耳毒性药物的敏感性不同，甚至同一物种不同品系、不同年龄个体对同一耳毒性药物的敏感性也有很大差异[1-3]，鉴于豚鼠对声音敏感性过强，造模死亡率过高，大鼠耳蜗组织结构不利于再生修复中的圆窗用药，CBA近交系小鼠个体差异小[4-5]，适应性较强，购买和饲养费用低廉，繁殖率较高，在内耳的胚胎发育，解剖形态、生理稳态等方面与人类相似性非常高，逐渐成为人类耳聋研究的理想模式动物，快速建立CBA小鼠急性耳毒性模型具有巨大的潜在价值。

KM是氨基糖苷类广谱抗生素，抗菌谱和新霉素相似[6]，它对耳蜗毛细胞的损伤作用研究较少，尤其是对CBA品系小鼠耳蜗基底膜毛细胞损伤方面的研究更少。Fur是一种利尿剂，可以治疗水肿性疾病也可以预防急性肾功能衰竭；然而呋塞米可引起体内水、电解质的紊乱，大剂量静脉快速注射时可引起短暂的耳鸣及听力障碍；有研究报道KM+Fur联合用药可导致耳毒性与肾毒性。因此，本研究拟通过硫酸卡那霉素联合呋塞米（KM+Fur）建立快速致聋CBA小鼠模型，通过检测ABR听力阈值的改变并结合耳蜗基底膜铺片HE染色综合观察，分析模型建立效果以及耳蜗毛细胞形态学的变化，为CBA小鼠耳蜗毛细胞损伤后再生修复，以及药物性耳聋相关性研究的治疗提供模型基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验选取5-8周60只雌雄各半的健康CBA小鼠（杭州师范大学实验动物中心提供）。小鼠耳廓反应灵敏，外耳道通畅，实验前检测ABR听力阈值均正常。剪脚趾标记，随机分为空白对照组、KM+Fur后 1 d组、KM+Fur后 3 d组、KM+Fur后 7 d组、KM+Fur后 14 d组、KM+Fur后 28 d组，每组10只。

1.2 实验试剂

硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate，KM），呋塞米（速尿 furosemide，Fur）Sigma公司；水合氯醛；4%多聚甲醛；磷酸盐缓冲液（PBS）；苏木素；伊红；无水乙醇；二甲苯；中性树脂（衢州巨化试剂有限公司）。

1.3 实验仪器与设备

听性脑干反应测试仪（美国TDT公司auditory brainstem response，ABR），解剖显微镜(Zeiss)，荧光倒置显微镜（Nikon），游丝镊。

1.4 实验步骤及方法

1.4.1 药物耳聋模型的建立

本研究对CBA小鼠进行ABR阈值检测后，采取一次性皮下注射硫酸卡那霉素，半小时后腹腔注射呋塞米。硫酸卡那霉素注射剂量为1 mg/g，呋塞米注射剂量为0.5 mg/g，进行建立药物耳聋模型，空白对照组不做任何处理。

1.4.2 ABR测试

各组在给药前进行ABR阈值检测，用于排除先天聋或其他原因耳聋的动物（听力阈值>45 dB则认为该动物听力异常），在给药后各时间点进行ABR阈值检测，测试在隔音屏蔽室内用美国TDT公司听觉诱发电位仪完成。方法：动物用5%水合氯醛溶液腹腔注射（0.1 mL/10 g）麻醉后置于恒温加热垫上，记录电极置于两耳中间（颅顶处），参考电极和接地电极分别放置在给声侧耳及对侧耳部乳突处皮下，外置耳机放于小鼠耳水平处，距离10 cm，正对外耳道；刺激声为短音（click burst），刺激频率20次/秒，扫描时间为10 ms，滤波范围100～3000 Hz，叠加 1024次，从 90 dB SPL开始，每 5 dB SPL递减，直到Ⅱ波消失记录为该动物的听力阈值，分别检测每只动物左右耳听力阈值。

1.4.3 HE染色

给药后分别在不同时间进行ABR检测小鼠听力阈值，检测完成后，将小鼠用5%的水合氯醛溶液进行麻醉，麻醉后脱颈处死，取出双侧耳蜗，用4%的多聚甲醛溶液进行固定24 h，将固定好的耳蜗剖去蜗壳，取出基底膜。取好的基底膜放在载玻片上，加苏木素染色10 min。用水冲洗5～10 s，用1%的盐酸乙醇冲洗5 s。放入水或PBS中10 min返蓝。将水吸去，加伊红染色 1 min。分别用 70、75、80、85、90、95、100%（无水乙醇）的乙醇冲洗 2～5 s。二甲苯透明2～5 s，风干后用中性树胶将样本封片固定。镜下观察结果。细胞核呈蓝紫色，胞浆为淡红色。

1.5 统计学分析

首先采用F检验行样本方差齐性检验，然后采用T检验比较组间差异，以P＜0.05为差异有统计学意义;ABR阈值检测数据以ABR阈值的均数表示，组间差异显著性采用SPSS22.0统计分析软件进行t检验。

2 结果

2.1 实验动物整体观察

纳入的实验小鼠为60只，随机分为6组，进行结果分析的动物为60只，实验过程中无脱失值。所有小鼠在在用药后行为表现及进食情况均正常，毛色光泽度好，未见任何中毒症状和死亡，各组小鼠用药后无强迫环绕运动、肢体外展、偏头、站立不稳等前庭功能异常现象。各组之间体重无明显差异。

2.2 建模前后ABR阈值变化

ABR检测是反映听功能的一项客观指标。小鼠听觉阈值位移（PTS）的变化，可作为本实验耳聋动物模型建立是否成功的评估依据。本研究建模前后采用自身对照，建模前先检测每组动物的左右耳听力阈值是否常，听力阈值大于45分贝的则认为该动物的听力存在问题，建立模型时则将听力存在异常的动物排除，建模时只对听力正常的动物进行给药；分别在给药后 1、3、7、14、28 d 进行样本的收集，收集样本前需进行ABR的检测，ABR检测结果表明给药后与给药前进行对比，听力阈值明显升高；建模前与建模后对比分析差异具有统计学意义（P<0.01），说明模型建立成功。

由图1可知，ABR检测的波形图在建模1 d后听力阈值明显升高，且与建模前的阈值相比较差异具有统计学意义（P<0.01）；随着建模时间的延长损伤后各组之间的ABR阈值无明显变化，从功能上说明急性耳聋动物模型建立成功。

2.3 建模前后ABRⅡ波振幅的变化

小鼠一般以ABR的Ⅱ波来作为听觉反应阈值的评判标准。Ⅱ波振幅会随着声强的变化而改变，李登科[7]研究结果表明声音从低到强变化时，振幅逐渐加强。由图2可知给药后ABRⅡ波振幅显著降低，与给药前相比，差异具有统计学意义（P<0.01）；而给药后各组之间进行对比，差异无统计学意义 (P>0.05)。

2.4 耳蜗基底膜HE染色铺片观察

从图3可以看出空白对照组耳蜗毛细胞的排列整齐；建模后1 d耳蜗底回毛细胞排列开始出现轻微的紊乱；建模3 d后耳蜗毛细胞排列紊乱增加；建模后7 d耳蜗毛细胞紊乱严重；建模后14 d耳蜗毛细胞已经看不出原来的排列方式；建模后28 d小鼠耳蜗毛细胞结构缺失，排列变形。由此可见，随着硫酸卡那霉素损伤时间的延长，给药后各组与空白对照组相比较外毛细胞排列越来越紊乱。

图1 建模前后ABR检测小鼠听力阈值的变化Fig.1 Changes of hearing thresholds in mice after ABR detection

图2 ABRⅡ波振幅分析Fig.2 ABRⅡwave amplitude analysis

图3 观察给药后耳蜗毛细胞的形态变化HE染色Fig.3 HE staining to observe the changes of cochlear hair cells after administration

3 讨论

氨基糖苷类抗生素对耳蜗的毒性机制至今仍不完全清楚[7-8]，而伴利尿剂可以促进KM进入内耳淋巴液。呋塞米或利尿酸等药物与KM联合应用时，可导致肾功能衰竭，推测其可能与伴利尿剂增强KM耳毒性的效应有关[7-8]，从而导致耳蜗的功能发生不可逆的改变[9]。卡那霉素和呋塞米联合应用，可严重损伤成年豚鼠耳蜗毛细胞，耳蜗底回毛细胞受损比顶回严重[10-11]。其中外毛细胞的损伤比内毛细胞严重，而引起感音神经性聋的主要原因之一是耳蜗外毛细胞受到损伤。本研究所选用的CBA小鼠为近交系小鼠，个体差异小，降低实验过程中的误差。研究表明CBA小鼠听力阈值和潜伏期更为稳定[12]，有研究用CBA小鼠进行慢性耳毒性的研究[13]，但未见报道用CBA小鼠建立急性耳毒性研究模型。

本研究使用的CBA小鼠建立的KM+Fur联合用药急性药物损伤致聋模型，用自身对照的方法，减少了动物个体差异所造成的实验误差。KM和Fur联合给药1 d后小鼠的ABR阈值升高，给药后1、3、7、14、28 d组ABR阈值均高于给药前，且具有统计学差异（P<0.01）；由Ⅱ波的振幅分析得出结果，给药后各组的振幅明显降低且具有统计学差异（P<0.01）；HE染色结果显示，给药后1 d，外毛细胞形态基本没有改变，随着观察时间的延长，外毛细胞的排列逐渐紊乱；由ABR阈值的检测、振幅分析和HE染色的结果可以看出：本研究所建立的快速致聋CBA小鼠模型，考虑听力阈值发生改变可能是由于外毛细胞排列紊乱导致的。

综上所述，KM+Fur一次性给药，给药后1 d观察CBA小鼠ABR阈值，明显高于给药前，且给药后28 d内ABR阈值无明显变化，提示该急性损伤致聋的方法导致听力损伤是不可逆的。该方法操作简单且损伤效果明显，为药物性耳聋实验研究提供了一种简单有效的建模方法。由于本实验采用的KM+Fur剂量单一、有局限性，有待于进一步的优化。