BMP7治疗大鼠脊髓损伤后NF200及GFAP表达的变化

张玉玲，白广超，金宏亮，张文，李宽新

（1新疆兵团医院教学科，新疆 乌鲁木齐 830000；2新疆兵团医院关节脊柱外科,新疆 乌鲁木齐 830000）

脊髓损伤（Spinal cord injury，SCI）是一种具有高发生率、高致残率的中枢神经系统疾病[1]，由于神经元细胞为不可再生细胞，损伤坏死的神经元细胞得不到补充，常规的手术+激素治疗方法并不能取得良好的治疗效果，故脊髓损伤后神经元细胞的保护及修复成为脊髓损伤治疗的研究热点[2]。目前研究表明，属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族的BMP7具有神经保护及促进间充质干细胞向神经元细胞分化的作用[3]。

因此，本研究于 2016年1-8月，使用BMP7治疗急性大鼠脊髓损伤，检测大鼠运动功能恢复情况及神经修复标志蛋白表达量的变化，以探索BMP7促进脊髓损伤后运动功能恢复的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠70只，4周龄，体重约120 g，购自新疆医科大学实验动物中心。实验前适应性饲养1周，自由进食、饮水，所有实验操作均符合实验动物伦理学要求。

1.1.2 主要试剂

BMP7（美国R＆D公司），0.9%氯化钠注射液（新疆华世丹药业有限公司），10%水合氯醛（上海联硕生物科技有限公司），大鼠NF200单克隆抗体、大鼠GFAP单克隆抗体（Wako公司，日本），羊抗鼠的IgG-HRP（上海容创生物技术有限公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），苏木素复染液（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），中性树胶（上海远慕生物科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器

动物手术器械（上海玉研科学仪器有限公司）、Allences′s打击器（石河子大学医学院第一附属医院骨科中心提供）、0.1 mm聚乙烯导管（上海桑戈生物科技有限公司）、光学显微镜E100（日本Nikon）、石蜡包埋机及切片机（东莞市谱标实验器材科技有限公司）、纯水器（成都超纯公司）、烘箱（北京昊诺斯科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠急性脊髓损伤模型的建立

把Wistar大鼠随机分为对照组和BMP7实验组，每组30只，10只备用。每只大鼠腹腔内注射10%水合氯醛进行麻醉（每100 g体重30 mg水合氯醛），术区碘伏消毒，以背正中切口暴露出第10胸椎硬脊膜，使用Allences′s打击器以15 g×20 cm的能量打击第10胸椎脊髓处，局部可见出血、水肿，大鼠出现痉挛性摆动，躯体回缩扑动，双后肢迟缓性瘫痪，表明造模成功[4]。随后把0.1 mm聚乙烯导管植入损伤处蛛网膜下，逐层缝合切口。术后连续3 d每天肌注4万U青霉素，每天给予2次膀胱按压辅助排尿直至自主排尿功能恢复，把BMP7粉末以超纯水溶解，制成浓度为500 ng/mL的BMP7溶液，0.1 mm聚乙烯导管外侧端适当扩大到100 μL移液枪头可以接入为宜，以100 μL移液器吸取BMP7溶液接入0.1 mm聚乙烯导管注射到脊髓损伤处，术后连续7 d进行BMP7注射，对照组大鼠则注射等体积的0.9%氯化钠注射液。

1.2.2 大鼠后肢运动功能恢复的行为学检测

术后 6 h、3 d、1、2、4、8 w 采用双盲法对各组大鼠进行BBB量表评分，实验大鼠置于光线充足的试验台上，由熟悉BBB评分方法的非本组实验人员进行观察评分，评分包括大鼠后肢关节运动情况、运动过程中的协调状态、大鼠后肢爪的的精细运动共计三部分，满分为21分[5]。

1.2.3 免疫组化检测各组大鼠脊髓损伤节段NF200及GFAP的表达量

术后 6 h、3 d、1、2、4、8 w 分别取 5 只大鼠，腹腔内注射水合氯醛进行麻醉，打开胸腔，以冰的4%多聚甲醛灌入大鼠左心室直至大鼠死亡，取背部原切口，以原损伤处为中心上下各0.5 cm处剪断脊髓组织，4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋后以切片机制作厚度为6 μm的组织切片，切片置于60℃烘箱内30 min以使蜡融化，二甲苯中脱蜡，酒精梯度脱水，0.3%H2O2甲醛室温浸泡10 min以消除内源性过氧化物酶活性，切片置于0.01 mol/L枸橼酸溶液中煮沸10 min以修复抗原，切片冷却后置于山羊血清封闭液中20 min，孵一抗（抗体稀释倍数为1∶200），4℃过夜。切片置于 37℃烘箱中复温45 min，PBS冲洗后室温孵二抗2 h（羊抗鼠 IgG，每张切片滴50 μL），随后按照DAB显色试剂盒说明书进行显色，苏木素复染2 min，1%盐酸酒精分化10 s，酒精梯度脱水，二甲苯透明，随后进行封片，置于光学显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 大鼠后肢运动功能BBB评分结果

对照组及BMP7实验组大鼠造模后双后肢运动功能完全丧失，1 w后开始逐渐恢复。在1、2、4、8 w时BMP7实验组大鼠BBB评分均高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 不同时间点大鼠BBB评分表±s，n=5Tab.1 BBB score table at different time points±s，n=5

表1 不同时间点大鼠BBB评分表±s，n=5Tab.1 BBB score table at different time points±s，n=5

注：*表示同一时间点与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。

分组? 术前? 6?h? 3?d? 1w? 2w? 4w? 8w?术后?对照组?BMP7实验组?21.00±0.00?21.00±0.00?0.00±0.00?0.00±0.00?0.00±0.00?0.00±0.00?0.33±0.02?0.50±0.05*?3.00±0.19?5.50±0.15*?4.33±0.52?8.00±0.63*?4.41±0.56?8.20±0.34*?

2.2 免疫组化检测各组大鼠不同时间点脊髓损伤处NF200及GFAP蛋白表达结果

对照组及BMP7实验组大鼠脊髓损伤节段均可见NF200及GFAP阳性表达的细胞（图1）。每张切片随机选取10个视野进行阳性细胞计数，取其平均值，结果表明：BMP7实验组大鼠NF200阳性表达细胞数术3 d后逐渐增多，至第4 w时达到高峰，且在 1、2、4、8 w时均大于对照组；BMP7实验组及对照组术后GFAP阳性表达细胞数变化均不明显，且2组阳性细胞数差异不显著（图2）。

图1 免疫组化检测不同时间点各组大鼠脊髓损伤节段NF200及GFAP蛋白表达结果（×400）Fig.1 The results of NF200 and GFAP protein expression in spinal cord injury segments in rats at different time points detected by immunohistochemistry(×400)

图2 免疫组化测得不同时间点各组大鼠脊髓损伤处NF200及GFAP阳性表达细胞数量Fig.2 The number of NF200 and GFAP positive cells in spinal cord injury at different time points detected by immunohistochemistry

3 讨论

脊髓损伤的病理过程有2个阶段：原发性损伤和继发性损伤[6]。原发性损伤是由外界机械原因引起的脊柱骨折、椎体滑脱等物理性损伤；继发性损伤是局部部位电解质失衡、炎症因子聚集等生物性损伤。继发性损伤可造成原发性损伤未波及到的相邻脊髓组织髓鞘受损及神经细胞死亡[7]。目前脊髓损伤的手术治疗是以恢复脊柱的稳定性为重心，其对于已受损神经细胞的恢复无直接促进作用，故手术治疗+神经营养因子+干细胞移植是目前脊髓损伤治疗的研究热点[8]。这一设想的实现，关键在于探索出有利于脊髓损伤后神经恢复的营养因子。

BMPs隶属于TGF-β超家族，最早发现其具有促进成骨的能力，故命名为骨形态发生蛋白，目前越来越多的研究表明其部分成员具有神经保护功能，例如BMP-7在目前的研究中发现在脊髓损伤早期据有抑制神经元细胞凋亡，促进疤痕形成，抑制局部炎症的作用[9]。胡岚翔等[10]对SD大鼠脊髓损伤模型给予BMP7静脉注射干预，随后检测到受损脊髓段GFAP表达量升高，表明BMP7在脊髓损伤后可以促进星形胶质细胞的增生，促进局部胶质瘢痕的形成，抑制炎症的发生，从而减轻了脊髓损伤后继发性损害的程度。因此，本实验组立项研究BMP7是否具有促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复，并进一步探索其具体机制，检验BMP-7是否为治疗脊髓损伤合适的营养因子。

本研究利用Allen法制备大鼠急性脊髓损伤模型，在损伤的早期于脊髓损伤处局部注射50 ng BMP7，随后在不同时间点以BBB评分检测大鼠运动功能恢复情况，结果表明BMP7实验组在1周后BBB评分高于对照组，差异具有统计学意义，这表明脊髓损伤后局部注射BMP7可以促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复。这与Sandner等[11]的研究结果相一致。以免疫组化法检测脊髓损伤处神经丝蛋白200及神经胶质纤维酸性蛋白表达情况进一步探索BMP7促进大鼠脊髓损伤的机制。神经丝蛋白200(neurofilament protein 200，NF200)主要存在于神经元细胞胞浆及轴突中，其表达量的高低反映了神经元细胞的数量及其功能状态[12]。神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形胶质细胞的特异性蛋白和骨架成分之一，其表达量的高低可反映星形胶质细胞增殖、坏死等改变的程度[13]。本实验组以免疫组化法检测术后各组大鼠脊髓损伤局部NF200及GFAP表达量的变化，结果表明BMP7组大鼠脊髓损伤处NF200表达量在3 d后明显升高，至第4 w时表达量达到最高并维持在较高水平，而GFAP表达量与对照组相比无明显差异。我们的研究表明了对脊髓损伤的大鼠局部注射BMP7后脊髓损伤节段处NF200的表达量升高而GFAP的表达量无明显变化，我们推测BMP7促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复主要是BMP7具有促进脊髓损伤处局部神经祖细胞向神经元细胞分化的作用，增加了损伤局部神经元细胞的数量，促进运动传导通路的修复。关于GFAP表达量的变化，本研究结果与胡凤翔等[10]的结果不同，他们在研究中发现BMP7具有促进脊髓损伤处GFAP表达量升高的功能，我们推测具体原因如下：胡凤翔[10]等人在试验中使用环扎法进行大鼠脊髓损伤模型的建立，不同的造模方式形成脊髓损伤的具体机制会不同，而且他们给予BMP7干预的方式为静脉内给药，不同的造模方式及给药方式使两个实验的结果完全不同。

总之，BMP7局部注射可以促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复，其机制可能是BMP7促进脊髓损伤局部神经祖细胞向神经元细胞分化，从而增加了神经元细胞的数量，促进运动传导通路的修复。这为BMP7在临床上的应用提供了理论依据，同时也为急性脊髓损伤的治疗提供了一个新思路。