AZD2014对体外细粒棘球绦虫原头蚴活性影响的研究

张中洲，邢立行，李智伟，王小义，姜慧娇，郭峰，吴向未*，陈雪玲

（1石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科，新疆 石河子 832008；2石河子大学医学院免疫学教研室，新疆 石河子 832002）

细粒棘球蚴病又称囊性包虫病（cystic echinococcosis，CE），是一种常见的人畜共患病。尤其是在亚洲地区的该疾病的发病率较高[1-2]。而人类CE是由寄生绦虫细粒棘球蚴幼虫引起的[3]，因此对囊性包虫病的治疗显得尤为必要。而目前对包虫病的治疗主要有手术和PAIR（Puncture-aspiration-injection-reaspiration）的侵入性治疗，以及药物性的非侵入性治疗，但目前两种方法均存在相应的副作用[4-5]，研发副作用少的新型低毒药物来治疗包虫病成为目前的趋势。由于囊性包虫病与肿瘤的临床表现相似，因此我们选择了化疗药物来治疗CE。此治疗方案能够成为防治包虫病的新的研究方向和切入点。

雷帕霉素（TOR）信号通路的PI3K-AKT-TOR在生物体内对机体核糖体合成和蛋白质生成起到了重要作用。其中的TOR蛋白激酶复合物在真核生物体内存在两种不同的功能结构：TORC1和TORC2[6]，它通过调节下游靶蛋白核糖体S6激酶-1（S6K1）和真核翻译起始因子 eIF4E结合蛋白1（4EBP1）以及AKT激酶来影响细胞的增殖，生长和运动[7]。TORC1和TORC2之间既能协同调节细胞的活性，也能通过负反馈作用而相互影响[8]。因此，只有同时阻断TORC1和TORC2才能有效地抑制TOR蛋白激酶活性，进而影响细胞信号通路PI3K-AKT-TOR。而AZD2014作为是一种新型的ATP竞争性抑制剂，研究表明它可以有效抑制TORC1和TORC2[9]。它不仅能抑制TORC1下游靶蛋白的活性，也能有效阻断TORC1和TORC2之间的负反馈通路。从而抑制肿瘤细胞的生长，或加速其死亡，或诱导其凋亡[10]。有望用于治疗占位性病变等肿瘤性疾病，成为新型化疗药物。

在这项研究中，我们在体外用不同浓度的AZD2014培养原头蚴，观察其对原头蚴活性的影响。我们希望为AZD2014治疗肝细胞棘球蚴病提供依据，为治疗包虫病提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 化学材料和抗体

AZD2014获自 Selleck（USA）。二甲基亚砜（DMSO），磷酸盐缓冲盐水（PBS），10%胎牛血清（FCS）和 RPMI1640购自 Gibco-BRL（USA）。Caspase-3检测试剂盒购自 Applygen（中国北京）。（p）-AKT1 S473（目录号 ab81283;1：5,000），磷酸化（p）-S6K1T389（目录号 ab2571;2μg/ml），磷酸化 （p）-4EBP1T37（AKT1（目录号 ab28422;1∶2,000），S6K1（目录号ab9366;1∶500）和 4EBP1（目录号 ab2606;1∶1,000），它们是从Abcam（UK）购买的。 GAPDH（目录号MB001;1∶10,000）从 Bioworld Technology，Inc。（USA）获得。第二抗体包括过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗兔 IgG（H+L）（目录号 ZB-2301;1∶10,000;USA）和山羊抗小鼠IgG（H＆L）-HRP（目录号BS1248;1∶10,000;Bioworld Technology，Inc.，USA）。

1.2 原头蚴的体外培养及处理

在新疆自治区昌吉市屠宰场收集自然感染细粒棘球绦虫的绵羊肝脏，带回实验室后进行彻底清洗并消毒，并于无菌条件下提取原头蚴。然后用PBS（pH7.2）洗涤取得的原头蚴，置于含有10%FCS的RPMI1640培养基中，于无菌条件（37 ℃；5%CO2）下培养使其适应体外生存环境。3 d后，取出已培养的原头蚴并用PBS（pH7.2）洗涤三次以去除无活性或者活性低的原头蚴。0.1%伊-红染色后于光学显微镜（Carl Zeiss Jena）下来观察上述原头蚴的活性，存活率≥98%可用于下一步试验。将上述原头蚴进行分组，每组约3000个，置于5 mL培养基中于无菌条件（37℃；5%CO2）下培养；取其中 6组标记为Blank，DMSO，25、50、100、200 μmol/L；向以上 6 组培养基内分别加入5μL的培养基，5μL的DMSO溶剂，2.5 μL的50 mmol/L的AZD2014溶液（AZD2014溶解于 DMSO溶剂），5 μL的 50 mmol/L的 AZD2014溶 液 ，2.5 μL的 200 mmol/L的AZD2014溶液，5 μL的 200 mmol/L的 AZD2014溶液；将上述分组培养的原头蚴置于无菌条件（37℃；5%CO2）下培养10 d。每3 d更换培养基1次，每组的添加剂同首次。以上操作均在无菌条件下进行。

1.3 光学显微镜下观察原头节存活率和形态

上述1.2中培养的6组原头蚴，每24 h从6组中分别取约100个原头节，0.1%伊-红染色后，于光学显微镜下观察每组原头蚴的存活率和形态变化。该实验重复3次，每次存活率测试持续10 d。以上操作均在无菌条件下进行。上述试验重复3次。

1.4 Western-blot检测TOR下游蛋白因子p-Akt1、p-4EBP1、p-S6K1 的表达量

Blank，DMSO，100 μmol/L 组的原头蚴培养 4 d后，用 PBS（pH7.2）反复清洗 3次后，分别将上述 3组原头蚴转移到3个无菌无酶EP管中。加入含有PMSF（Thermo Fisher Scientific，Inc.） 和磷酸酶抑制剂 混 合 物 （Thermo Fisher Scientific，Inc.） 的 RIPA（Thermo Fisher Scientific，Inc.）缓冲液以提取上述3个蛋白质样品。通过BCA（Thermo Fisher）测量蛋白质样品的浓度之后，根据所测3组蛋白的最低浓度配平其他提取蛋白样品。然后对上述配平的蛋白进行Western-blot检测，通过检测蛋白印迹的相对灰度值来检测 TOR下游蛋白因子 p-Akt1、p-4EBP1、p-S6K1的表达量。上述试验重复3次。

1.5 原头蚴Caspase-3酶活性检测

取上述1.2中Blank，DMSO，100μM组的原头蚴培养4 d后，用 PBS（pH7.2）反复清洗 3次后，分别将上述3组原头蚴转移到3个无菌无酶EP管中。根据Caspase-3试剂盒的说明书，检测3组原头蚴Caspase-3酶活性。上述试验重复3次。

1.6 统计学分析

以上试验所得数据使用SPSS20.0软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）用于统计分析。结果表示为平均值±标准偏差（SD）；符合正态分布的数据，多组之间比较采用单因素方差分析（ANOVA），两组之间比较采用T检验，当P<0.05时，比较的差异性具有统计学意义。

2 结果

2.1 AZD2014对体外原头形态的影响

在光学显微镜下观察原头节。在对照组（Blank，DMSO组）中，原头蚴体积较大，且个体的形态和结构完整，未被伊-红染液着色（图1A、图1B）。在实验组（25、50、100、200 μmol/L 组）中，随着 AZD2014浓度的增加以及培养时间的延长，原头蚴体积缩小越明显，并且其虫体的形态和结构破坏越严重，一些原头蚴的顶部小钩从虫体内脱落，吸盘逐渐变形，透明度逐渐减少；更易被伊-红染液着色（图1C-1F）。因此，原头蚴形态和结构的变化对AZD2014具有剂量和时间依赖性的。

图1 AZD2014作用4 d后的原头蚴(50X)Fig.1 The protoscoleces were cultivated by AZD2014 for 4 days(50X)

2.2 AZD2014在体外对原头生存率有影响

取 Blank，DMSO，25、50、100 和 200 μmol/L 各组原头蚴，伊红染色后，每24 h观察一次原头蚴活性，在光学显微镜下连续观察10 d并统计各组原头蚴的存活率，并绘制存活率图（图2）。空白组和DMSO组的原头蚴存活率没有明显变化。

在25 μmol/L和50 μmol/L组中原头蚴存活率的变化不明显。而100 μmol/L和 200 μmol/L组的原头蚴活性却发生了显着变化，在AZD2014作用后的第4天其成活率分别为75.93%±7.28%，41.02%±34.62%；与对照组（Blank组，DMSO组）相比，差异有统计学意义（P<0.05）。

图2 原头蚴活力曲张图Fig.2 The vitality chart of protoscoleces

2.3 AZD2014对体外培养原头蚴的p-AKT1，p-4EBP1和p-S6K1表达的影响

100 μmol/L的AZD2014体外作用于原头蚴4 d后。其中Blank和DMSO两组中p-AKT1，p-4EBP1和p-S6K1的表达水平变化不明显，差异无统计学意义。

而 100 μmol/L组中原头蚴的 p-AKT1，p-4EBP1和 p-S6K1的表达量为：19.40±2.87，11.52±3.68，14.94±0.29；水平明显低于 Blank和 DMSO组，差异有统计学意义（P<0.05）（图 3）。

图3 原头蚴蛋白因子p-AKT1，p-4EBP1和p-S6K1表达情况Fig.3 The expression of P-AKT1、P-4EBP1 and P-S6K1 in protoscoleces

2.4 AZD2014对体外培养原头蚴的Caspase-3酶活性的影响

100 μmol/L的 AZD2014体外作用于原头蚴 4 d后，其中Blank组和DMSO组的Caspase-3酶活性变化不明显，差异无统计学意义。

而 100 μmol/L组 Caspase-3酶活性为:59.67±2.94；与对照组（Blank，DMSO 组）比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图 4）。

图4 原头蚴凋亡因子Caspase-3表达情况Fig.4 The expression of apoptesis factor caspase-3 in protoscoleces

3 讨论

目前，化疗药物是人类CE的主要非侵入性治疗药物，如口服阿苯达唑和苯并咪唑等药物[2,4]。除了H2O2，20%的高渗盐水，95%的酒精等局部化疗药物外，也会引起不诸多良反应。同时局部化疗药物对于治疗人类CE也是特别不理想的。以治疗CE为目标，我们开发了一种新的促进原头节细胞凋亡的抗肿瘤化疗药物。

TOR是PI3K-TOR细胞内信号传导途径中的蛋白质调节激酶之一。当TOR受到抑制，PI3K-TOR途径被阻断时，细胞的生物活性将受到显著影响[11-13]。在我们的研究中，用于临床试验的AZD2014[14-15]用于体外培养细粒棘球蚴原头节。研究了不同浓度AZD2014对原头节的影响。在我们的研究中，AZD2014作用于原头蚴4 d后，其存活率为79.82%±10.65%。在第1天和第7天，100 μmol/L组原球蛋白的存活率分别为97.03%±0.76%和66.65%±12.35%。在100 μmol/L组中，粒细胞质原颗粒的生存力的变化是逐渐变化的。上述结果表明AZD2014可阻滞TOR酶活性的表达。

AKT1，S6K1和 4EBP1是 TORC1和 TORC2蛋白激酶的下游蛋白[16]。因此，当TORC1和TORC2被阻断时，AKT1，S6K1和4EBP1磷酸化水平的表达量会明显降低[17-18]。而在本实验研究中，AZD2014作为双TOR抑制剂作用于原头蚴，通过Western-blot进一步验证表明，在AZD2014作用于原头蚴4 d后，其p-AKT1，p-S6K1和p-4EBP1的表达量均出现明显下降，说明AZD2014在原头蚴体内阻滞了AKT1，S6K1和4EBP1 3个蛋白因子的磷酸化过程，进而影响原头蚴的活性。

真核细胞死亡通常涉及细胞凋亡和程序性细胞死亡。Caspase-3是细胞凋亡的一个分子，具有相同的其他诱导细胞凋亡的细胞因子的代谢途径。研究表明Caspase-3及其家族的caspase介导物是细胞凋亡的关键蛋白酶[19]。随着Caspase-3及其家族caspase介导的过度激活和表达，细胞死亡水平增加[20-21]。一些科学家声称，Caspase-3参与原头节细胞凋亡，并呈现高水平。具体而言，活性中的胱天蛋白酶-3的活性高于粒状原粒体的无活性囊肿。因此，本实验结果表明，100 μmol/L组的原头蚴在培养4 d后，其Caspase-3酶活性表达量明显升高，因此AZD2014可加快原头蚴的死亡。

实验结果表明，AZD2014对细粒棘球蚴原头蚴有显著的抑制杀灭作用。将AZD2014通过靶向途径来治疗包虫病，有望为人类包虫病的治疗提供新的方案。本实验研究为治疗包虫新药的研究提供了新的方向。为进一步验证实验，我们将在动物模型体内进行该类药物的体内试验，探索AZD2014对人体的有效性和安全性，为临床医学提供理论基础。