胆汁对体外培养人细粒棘球蚴原头蚴生长发育的影响

郭炜，王朝阳，于云宝，雷振，朱东阳，刘国生，吴向未，彭心宇，张宏伟*

（1石河子大学医学院，新疆 石河子 832002；2石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科，新疆 石河子 832002）

细粒棘球蚴病（echinococcosis）又称为囊性包虫病（cystic echinococcosis，CE）是包虫病的最常见类型，由细粒棘球蚴绦虫的续绦期幼虫寄生于人体及某些动物体内所致的一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人畜共患慢性寄生虫病[1-2]，多发于肝脏，呈世界性分布，新疆是高发区，其流行趋势严重，是牧区“因病致贫、因病返贫”的重要原因之一[3]。目前，肝包虫病的感染途径以及治疗方案的选择已非常熟悉[4]，但其自然病程即包虫在人体内生长发育到衰老死亡的过程，目前尚不清楚。

根据WHO影像学分型[5]，包虫活性逐渐降低，钙化包虫认为是死亡包虫。包虫在体内生长发育过程中，面临诸多因素如：营养、胆瘘、感染等，这些因素均可影响到包虫囊肿的发育。在包虫漫长的生长过程中，包虫所处的环境恶化，包虫会逐渐走向死亡。杨宏强等[6]报道一组行“肝包虫囊肿‘外膜’内完整摘除术”治疗的172例囊性肝包虫病例中，术中证实合并胆瘘的病例47例，占27.33%。临床观察发现囊性肝包虫病合并胆瘘时，囊肿整体活性多处于过度阶段(III/IV型)，属趋向死亡阶段。胆汁是不是包虫死亡的启动因素之一。目前尚不清楚。本研究通过模拟胆瘘形成胆汁进入囊内原头蚴生活的微环境，体外培养人细粒棘球蚴原头蚴，观察原头蚴的生长发育情况，从实验室研究角度，初步探讨胆汁对包虫原头蚴及幼囊的体外作用，为进一步研究包虫病的自然病程提供一些理论基础。

1 材料与方法

1.1 人细粒棘球蚴原头节的采集

选择采用开放式外膜内完整摘除术手术的包虫病患者，取出内囊，用含双抗的PBS液冲洗三遍，收集沉淀，弃上清，将收集的沉淀在37℃下，用1%的胃蛋白酶（GIBCO）作用20 min，消化组织块再用PBS液冲洗3遍，沉淀原头蚴，去除PBS液。

1.2 胆汁的采集

胆汁来源于石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科。方法：（1）术中用30 mL无菌注射器从胆囊息肉患者的胆囊中抽取胆汁，放入高压过的无菌瓶备用。（2）收集我科做T管引流病人的胆汁，选取颜色清亮，无污染的胆汁。将收集的胆汁各取5 mL按常规及时接种于血平板(英国，OXOID 公司)上，35℃孵育24 h，若无细菌生长可用于实验。

1.3 原头蚴的活性检测

取消化之后的原头蚴孵育在培养液中，置于倒置显微镜下观察原头蚴的活性和形状。用0.1%伊红染色，3 min后在倒置显微镜下观察原头节活力（活的原头蚴不着色，活力差或死亡的原头蚴染成红色）分别计数不染色活原头蚴和染色的死原头蚴数，活力达90%以上才可用于原头蚴的培养。

1.4 实验分组

分为3个实验组，Ⅰ组为纯胆囊胆汁组，Ⅱ组为RPMI-1640＋肝内胆汁（2∶1）组，Ⅲ组为 RPMI-1640组，各组体积为5 mL。每组以2000枚/mL的浓度分别加入原头蚴。

1.5 原头蚴的培养

将处理好的原头蚴用PBS液稀释至合适体积，混匀从中抽取5 μL至于载玻片，在倒置显微镜下记录活原头蚴数，重复3次，最后求出平均值，然后算出总数和浓度。按上述分组和浓度，分别将原头蚴置于各组培养液中。在37℃条件下，5%CO2培养箱中连续培养。

1.6 观察指标及评判标准

每天抽取50 μL原头蚴，用0.1%伊红染色10 min后，在倒置显微镜下（随机选择3个视野）观察视野内原头蚴的外观及内部结构清晰度变化，评判标准见表1、表2。观察原头蚴的活动情况，用公式“原头蚴的活动度=活动的原头蚴÷成活原头蚴总数”；“顶泡形成率=出现顶泡的活原头蚴数÷成活原头蚴总数”，计算出顶泡形成率。利用公式“头节外翻率=头节外翻的活原头蚴数÷成活原头蚴总数”，计算出头节外翻率。绘出原头蚴的生长曲线图。

表1 外观度评分Tab.1 The score of appenrance

表2 内部结构清晰度评分Tab.2 The score of internal structural clarity

2 结果

2.1 各组原头蚴外观及内部结构清晰度

Ⅰ组中95%原头蚴在第9天其外观及内部结构完全破坏，而Ⅱ组和Ⅲ组中80%原头蚴第14天仍可观察到具有较好的外观及内部结构（图1）。

2.2 原头蚴活动度情况

Ⅰ组中原头蚴在胆汁的刺激下第1天活动度达60%，随着作用时间延长，在第6天活动度逐渐降低；Ⅱ组中的原头蚴随着能量耗竭，在第7天活动度逐渐下降。而Ⅲ组中原头蚴随着时间的延长，在显微镜下可见更多的原头蚴蠕动，活动度逐渐增加（图2）。

图1 体外培养人细粒棘球蚴原头蚴外观及内部结构清晰度评分Fig.1 Appearance and internal structure clarity score of humanEchinococcus granulosusin vitro

图2 原头蚴活动度情况Fig.2 The activity of the E.granulosus protoscoleces

2.3 原头蚴顶泡形成情况

在培养过程中Ⅱ组和Ⅲ组中的原头蚴分别在第5天和第4天开始出现顶泡，并随时间的延长出现顶泡的原头蚴数量逐渐增加，而Ⅰ组中的原头蚴没有顶泡的形成（图3）。

2.4 原头蚴头节外翻情况

3个实验组中原头蚴的头节外翻率均随培养时间延长外翻率逐渐增加。在培养前，大部分原头蚴头节内陷，顶突和小钩镶嵌于原头蚴的体内，同时可看见原头蚴体内有很多钙颗粒，经染色后呈黑色的小点状。原头蚴形状呈梨形或椭圆形。原头蚴培养至第6天时，原头蚴头节外翻率较高，可看到原头蚴的顶突、小钩和4个吸盘，外翻的原头蚴可看 到顶突和吸盘有明显伸缩的运动（图4）。

图3 原头蚴顶泡的形成Fig.3 The formation of the top bubble

图4 原头蚴头节外翻率Fig.4 The rate of the first section of valgus

2.5 胆汁刺激下原头蚴的生长情况及原头蚴成囊发育

通过连续培养观察，Ⅰ组中原头蚴在胆汁的刺激下活动度增加，外翻头节数量增加。

第14天时可观察到视野中的原头蚴体积明显缩小，对伊红染色无排斥力，形状变得不规则，内部结构不清晰，钙颗粒消失，外翻的原头蚴头钩脱落或排列紊乱，大部分原头蚴死亡，无成囊发育的原头蚴（图 5）。

图5 Ⅰ组中原头蚴第6天、第14天发育情况（×50）Fig.5 The development of protoscoleces at day 6、at day 14 in group Ⅰ(×50)

Ⅱ组中大部分原头蚴体积缩小，头节内陷，死亡的原头蚴数量增加，仅少量培养的原头蚴成囊，囊的体积明显小于同阶段Ⅲ组中原头蚴的囊的体积（图 6A）。

第Ⅲ组中原头蚴逐渐向囊方向发育，顶突和小钩镶嵌在囊上，顶突开始萎缩，吸盘逐渐退化甚至消失，原头蚴体内的钙颗粒消失，原头蚴呈肥大略透明的冬瓜状或葫芦状(图6B)

图6 Ⅱ、Ⅲ组原头蚴第23天发育情况（×50）Fig.6 The development of protoscoleces on day 23 in group Ⅱ、Ⅲ(× 50)

3 讨论

课题组前期将体外用胆汁处理过的原头蚴接种于小鼠腹腔，发现试验组小鼠体内的囊肿生长受到抑制。但由于仅仅模拟了一次胆瘘现象，并不能清楚解释胆汁长时间作用于原头蚴对其生长发育的影响，因此，我们进一步设计该实验，模拟胆瘘发生后胆汁进入人包虫囊肿内原头蚴生活的微环境，体外观察胆汁对人原头蚴生长发育的影响。

实验过程中我们发现Ⅰ组及Ⅱ组中的原头蚴较Ⅲ组中的原头蚴生长缓慢，尤其是Ⅰ组中95%原头蚴在第9天其外观及内部结构出现了严重的损害；Ⅰ组和Ⅱ组中的原头蚴在胆汁的刺激下活动度较Ⅲ组明显增加，但随作用时间的延长，能量的耗竭其活动度下降；Ⅰ组和Ⅱ组中原头蚴的体积也较培养前明显缩小，死亡原头蚴的数量随培养时间的延长逐渐增加。说明纯胆汁对原头蚴的生长有一定的抑制作用，长时间的作用能够破坏原头蚴的形态结构，造成其死亡。同时我们也观察到在培养第14 d纯胆汁培养组仍有少量存活的原头蚴，也进一步证实了胆汁并不能直接杀死原头蚴，但随着作用时间的延长可能会加速原头蚴的死亡，从另一方面也说明了，原头蚴具有极强的生命力，在恶劣的条件下仍可存活。与孙冯等[7]研究发现100%胆汁作用于羊肝细粒棘球蚴原头蚴4 d后原头蚴的死亡率达100%的结果不一致，可能胆汁来源不同，对不同宿主来源的原头蚴的作用不同。J.D.Symth等[8-9]也研究发现不同宿主胆汁成分对包虫的作用不同。

Zhang等[10-11]利用RPMI-1640为主的培养液对羊细粒棘球蚴原头蚴体外培养观察其生长变化，第14天开始向囊方向发育，第56天，约有10%的原头蚴发育成外周有一层薄薄的角质层囊。我们在连续培养观察原头蚴的生长过程中发现，Ⅰ组中的原头蚴还没有向成囊发育时已死亡，而Ⅱ组和Ⅲ组中的原头蚴均有向成囊发育，在培养的第20天时可以观察到原头蚴顶突和小钩镶嵌在囊上，顶突开始萎缩，原头蚴体内的钙颗粒消失，成半透明状，形态各异呈葫芦形、圆形、椭圆形等。Ⅲ组中原头蚴变化更为明显。对比Ⅲ组中原头蚴的变化，Ⅱ组中成囊发育的原头蚴的数量明显减少，成囊发育的时间滞后，囊的体积较小，头节内陷，大部分死亡。进一步证明胆汁可以抑制原头蚴成囊发育，但不能完全阻止其发育，也就是说，在真实的人体环境内，即便发生胆瘘，胆汁进入到包虫囊肿内，也不会在短时间内将所有的原头蚴杀灭，部分原头蚴在条件改变后仍可发育为独立的囊（子囊），也可解释有胆瘘存在的包虫囊肿可呈现多子囊表现的临床现象。

世界卫生组织把囊性肝包虫病根据其影像学特征分六型：囊型病灶型（CL型）、单囊型（I型）、多子囊型（II型）、内囊破裂型（III型）、实变型（IV型）、钙化型（V型），并由此确定囊性肝包虫病在体内的自然病程变化也遵循从CL型到V型的变化过程，病程长达十几年[12]。资料表明CL型、I型、II型囊内包虫具有活性，III型囊内包虫部分有活性，部分已经死亡，IV型、V型囊内包虫没有活性，已经死亡。马志刚等[13]研究发现囊型肝包虫病囊肿分型从CL型向V型演变，胆瘘发生率逐渐增高。且原头蚴的活性和发育能力与胆瘘的发生率成负相关。因此可推断，胆汁进入到囊肿内后，不能完全杀死头节，部分头节形成子囊，并逐渐发育，最终由于营养耗竭或持续胆汁刺激而发生子囊破裂，其内原头蚴继续成囊发育，周而复始，导致包虫在有限的空间内不断繁衍生存，此过程中，胆汁内细菌的作用可能较弱，虽有研究者认为[14-15]肝包虫的外囊壁包埋着许多小胆管，长期压迫可导致发生胆瘘，胆道中细菌随胆汁进入包虫囊内而引起感染，进一步导致包虫死亡。我团队研究发现，细菌可导致包虫原头蚴的迅速死亡。

本实验只能在一定程度上反映了人胆汁对人肝包虫原头蚴的生长发育作用，但是不能真实的模拟包虫胆瘘发生以后，包虫囊肿的病理生理学变化，因为此过程极为漫长，因此，包虫在人体动态变化的环境中是如何发展变化的还有待进一步研究。