ADAR2在妊娠期糖尿病产妇胎盘中的表达及干预机制
2018-07-19
(开封市妇幼保健院,河南 开封 475002)
妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)指妊娠期间发生或者首次发生的不同程度的葡萄糖不耐受,但不排除妊娠前存在糖代谢异常的可能[1,2]。妊娠期糖尿病导致胎儿呼吸窘迫综合征症和巨大胎儿等并发症增加,其治疗先以运动饮食为主,如控制严重不佳再给予胰岛素干预。MTNR1A等不同基因多态性与GDM发病相关[3]。该病发病机理未阐明,DNA和RNA编辑修复功能基因多态性与其有一定相关性。本研究旨在通过检测妊娠期糖尿病和正常产妇胎盘中ADAR2的表达情况,并分析运动饮食治疗和胰岛素治疗的胎盘表达ADAR2是否有明显差异,报告如下。
1 资料与方法
1.1 免疫组化
收集妊娠糖尿病产妇的胎盘组织,按照传统方式进行组织石蜡切片制作,脱蜡后复染色。ADAR2表达以细胞质内出现棕黄色颗粒为判定阳性细胞的标准,随机选取5个400倍视野观察记录。评分标准0为阴性,1~4分为弱阳性(+),5~8分为阳性(++),9~12分为强阳性(+++)。
1.2 光学显微镜和透射电镜观察细胞形态
通过倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态学变化并照相。收集培养的细胞用4℃预冷的2%戊二醛固定2 h,再用0.1M二甲砷酸钠缓冲液换液三次,每次2 h。之后用1%锇酸4℃固定2 h,用0.1M二甲砷酸钠缓冲液换液二次,每次15 min。接着梯度酒精脱水,环氧丙烷渗透,包埋,制备超薄切片,透射电镜观察细胞超微结构。
1.3 Western bolt
利用RIPA Buffer 裂解液提取各组细胞总蛋白,取20μL各组已处理的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并在恒流200 mA,冰水浴条件下电转60 min转移至PVDF膜上,5%的脱脂奶粉封闭液完全封闭1 h,以封闭液按1∶1 000稀释乙抗体,将上述PVDF膜浸泡其中孵育3 h后,用TBST溶液洗膜,然后与1∶8 000稀释的二抗孵育1 h后利用ECL试剂盒化学发光显色。
1.4 实时荧光定量PCR 法检测
Trizol法提取SKOV-3和SKOV-3-Taxol细胞总RNA, RT-PCR 试剂盒逆转录制备cDNA,进行PCR扩增。 2-△△CT法计算mRNA的相对表达量,以GAPDH作为内参. 每个实验组重复3次。
1.5 统计学方法
采用SPSS 21.0 进行数据分析,不同组间实验数据的比较均采用单因素方差分析,两组间的比较采用 LSD-t 检验,检验水准 α= 0.05。
2 结果
2.1 免疫组化检测妊娠糖尿病产妇胎盘的ADAR2表达
妊娠期糖尿病(A组)和妊娠期非糖尿病(B组)中ADAR2阳性表达率分别为92.7%(38/41)和84.6%(33/39)。如图1AB分别表示A组的低倍镜(x100)和高倍镜(x400)表达均高于B组(图C、D)。其中,A组中ADAR2阴性3例,弱阳性5例,阳性17例和强阳性19例;B组中ADAR2阴性6例,弱阳性18例,阳性11例和强阳性6例。
2.2 电镜下检测妊娠糖尿病产妇胎盘的ADAR2表达
透射电镜下观察滋养层细胞和细胞中,妊娠期糖尿病组的胎盘中,结果发现对照组中ADAR2定位于细胞膜、微绒毛和部分细胞浆内(图2A,x10 000)。微绒毛内ADAR2表达强阳性(图2B,x15 000)。运动和饮食治疗妊娠期糖尿病组的胎盘中,ADAR2主要定位于微绒毛、细胞膜和细胞浆中,弱阳性表达(图2C,x12 000)。微绒毛内ADAR2表达弱阳性(图2D,x25 000)。胰岛素治疗妊娠期糖尿病组的胎盘中,ADAR2主要定位于微绒毛、细胞膜和细胞浆中,弱阳性表达(图2E,x8 000)。微绒毛内ADAR2表达弱阳性(图2F,x15 000)。
图1 妊娠糖尿病和正常产妇胎盘中ADAR2的表达
图2 电镜下妊娠糖尿病和正常产妇胎盘中ADAR2的表达
2.3 Western Blot和PCR检测妊娠糖尿病产妇胎盘的ADAR2表达
与B组相比,A组胎盘中ADAR2 mRNA相对水平明显上升(2.47±0.15对比1.83±0.13,P<0.05),其中运动饮食治疗C组和胰岛素治疗D组的ADAR2 mRNA相对水平明显低于A组,分别为(1.89±0.13)和(1.73±0.04)。见图3a和3b。
2.4 Western Blot检测产妇胎盘的ADAR2蛋白表达
Western Blot检测ADAR2 蛋白表达结果显示与B组相比,A组胎盘中ADAR2 蛋白明显上升(2.51±0.15对比1.81±0.10,P<0.05),其中运动饮食治疗C组和胰岛素治疗D组的ADAR2 mRNA明显低于A组,分别为(1.82±0.05)和(1.79±0.05)。见图3c和3d。
图3 妊娠糖尿病和正常产妇胎盘中ADAR2的mRNA和蛋白表达
3 讨论
妊娠期糖尿病是困扰妊娠妇女的常见问题,导致胎儿呼吸窘迫综合征和巨大胎儿等并发症发生率明显增加。不同基因多态性与GDM发病相关,主要相关基因包括MTNR1B、TCF7L2和IRS1等,基因多态性发生率显著高于妊娠期非糖尿病产妇,且亚洲人群的TCF7L2和PPARG基因多态性与妊娠期糖尿病存在一定相关性,但在高加索人群未发现类似结果[4,5]。
RNA编辑是转录后mRNA和tRNA碱基变化现象,RNA编辑酶ADAR2是ADAR家族中关键酶,编辑底物主要是谷氨酸受体等[3]。本研究结果显示ADAR2在妊娠期糖尿病A组胎盘表达阳性率较高。与妊娠期非糖尿病B组相比,妊娠期糖尿病A组胎盘中ADAR2 mRNA明显上升,其中运动饮食治疗C组和胰岛素治疗D组的ADAR2 mRNA明显低于妊娠期糖尿病组。关于ADAR2基因调控葡萄糖代谢的研究较少,其血糖调控机制失调可能是胰岛细胞和胎盘细胞中ADAR2表达上升造成,与JNK磷酸化水平上升相关。在本研究中,后续检测ADAR2蛋白表达,其变化与mRNA变化结果相似,进一步证实胎盘ADAR2的表达失调与血糖调节失调相关。通过运动饮食治疗组和胰岛素治疗,均能改善患者的血糖失调严重程度,可能与降低ADAR2表达存在显著关系。目前胰岛素与ADAR2表达相关报道不多。Yang等证实ADAR2在胰腺细胞中参与调节糖代谢,且与神经递质受体和离子通道功能相关。在基因沉默ADAR2的胰腺细胞中结果显示ADAR2的基因沉默显著影响葡萄糖刺激的胰岛素分泌,并且显著降低氯化钾刺激的胰岛素分泌[5]。ADAR2定位于胰岛内分泌细胞,在胰岛素抵抗的小鼠胰腺组织中可见长期喂养高脂肪饮食的ADAR2表达翻倍,同时高脂肪饮食可诱导代谢应激,在胰岛细胞中明显增强RNA的转录编码离子型谷氨酸受体亚单位。此外,在空腹能量不足时,ADAR2蛋白表达受到抑制,但在给小鼠喂养后可完全可逆转ADAR2的低表达情况。
ADAR2与II型糖尿病基因多态性存在一定相关性,主要表现在亚洲印度人群中。且ADAR2可以结合dsRNA通过碱基碱基相互作用编辑RNA,其底物主要是以谷氨酸受体为主,与GluA2相关,介导疼痛中ADAR2表达及作用。
总之,ADAR2表达在妊娠期糖尿病产妇的胎盘中高表达,运动饮食干预和胰岛素治疗可下调其ADAR2表达水平,提示ADAR2可能是妊娠期糖尿病治疗的潜在靶点,为临床上妊娠期糖尿病饮食指导和胰岛素治疗提供理论依据。