致病性大肠杆菌致结肠癌细胞微绒毛损伤的毒力分子研究
2018-09-04周诗璞林华杨健
周诗璞,林华,杨健
(1.通江县人民医院感染科,四川 巴中 636700;2.四川省出入境检验检疫技术中心,四川 成都 610041;3.川北医学院基础医学院,四川 南充 637000)
致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)是发展中国家引起婴幼儿腹泻的一个重要病原体[1-2],EPEC感染宿主细胞典型的改变是:细菌先黏附宿主上皮细胞,接着在细菌黏附的地方有基垫形成,最后造成小肠上皮细胞微绒毛脱落损伤,整个病理过程简称为黏附、脱落损伤(attaching and effacing lesion,A/E)。近年来,对EPEC的致病机制的研究发现:EPEC是通过自身编码表达的Ⅲ型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)向宿主细胞注入毒力分子(比如外膜蛋白受体Tir、分泌蛋白EspF、Map等)发挥相应的生物学效应,尽管对EPEC的致病机制研究取得了较大的进展,但对EPEC参与宿主上皮细胞微绒毛损伤的效应分子仍未清楚[3],本研究用EPEC多种效应分子删除株感染极化培养的结肠上皮肿瘤细胞TC-7,用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)检测细菌黏附和微绒毛脱落损伤,以探讨参与细菌黏附和微绒毛损伤的效应分子。
1 材料方法
1.1 材料
菌株、细胞和质粒EPEC野生型(2348/69)、EPEC T3SS删除株(Δcfm-14)、EPEC束状菌毛删除株(ΔbfpA)、EPEC外膜蛋白删除株(Δeae)、EPEC外膜蛋白转位受体删除株(Δtir)、效应分子Map和EspF联合缺失株(Δmap espF)、效应分子Map缺失株(Δmap)等由英国纽卡斯尔大学Brendan Kenny教授惠赠,TC-7细胞由本实验室保存、质粒pACYC184-espF、pACYC184-bfpA、pACYC184-tir和pACYC184-intimin由本实验室构建保存。
试剂和仪器细胞培养基DMEM购自Invitrogen公司,电转仪购自BIO-RAD公司,PCR试剂盒购自大连宝生物有限责任公司,扫描电镜购自英国Cambridge公司,生物安全柜购自Thermo公司。
1.2 方法
1.2.1 TC-7细胞培养与感染 TC-7 细胞生长DMEM中(含2 mmol/L的谷氨酰胺,1%的非必须氨基酸,10%加热灭活的胎牛血清),待细胞长满培养瓶,消化细胞,并按1∶1稀释接种细胞到Transwell小室中,持续培养20 d,使细胞极化(在此期间,每两天换细胞基底侧和刷状缘侧培养液各1次),感染前2~3 h,用37 ℃预热的DMEM洗涤细胞。
1.2.2 质粒转染 用冰冷蒸馏水洗涤EPEC基因删除株3次以制备感受态细胞,-80 ℃保存备用。电转前,取1 μL质粒和感受态细胞相混合,冰上孵育30 min,用电穿孔方式转染EPEC(1 500 v 5 ms),把细菌均匀涂布含有25 μg/mL氯霉素的平板上筛选转化子,并用PCR鉴定转化子,PCR阳性的转化子用于进一步的感染实验。
1.2.3 SEM检测束状菌毛在EPEC黏附中的作用 实验分为未感染组、ΔbfpA感染组、ΔbfpA/pACYC184-bfpA感染组和EPEC野毒株感染组,分别接种细菌到含有25 μg/mL氯霉素的LB培养液中,静置于37 ℃培养过夜;次日,接种10 μL过夜培养物到2 mL无血清的DMEM培养液中于37 ℃、5%CO2的孵箱诱导培养3 h ;吸出Transwell小室中培养液,加入500 μL诱导后的细菌感染TC-7细胞,于37 ℃,5%CO2感染2 h;用预热的PBS洗涤细胞4次,以清除游离的细菌;用2.5%多聚甲醛和2.5%的戊二醛混合液于4 ℃固定细胞过夜;弃去固定液体,并逐级脱水:顺序用20%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇脱水5 min,标本临界点干燥,喷金,SEM检测细菌的黏附,菌落的形成以及微绒毛的脱落。
1.2.4 SEM检T3SS在细菌黏附及微绒毛损伤中的作用 分别用T3SS删除株Δcfm-14、EPEC野生型感染极化的TC-7细胞,并以未感染组做实验对照,感染方法同前,并于感染的15 min、30 min、60 min用SEM检测细菌的黏附及微绒毛脱落损伤。
1.2.5 SEM检测Tir和intimin在细菌黏附及微绒毛损伤中的作用 同样方法用Δeae删除株、Δtir删除株、Δeae/pACYC184-intimin和Δtir/pACYC184-tir互补株感染TC-7细胞2 h,SEM检测细菌的黏附及微绒毛脱落损伤。
1.2.6 SEM检测Map和EspF在细菌黏附及微绒毛损伤中的作用 同样的方法用ΔespF、Δmap espF、Δmap删除株以及Δmap espF/pACYC184-espF互补株感染TC-7细胞2 h,SEM检测细菌的黏附及微绒毛脱落损伤。
2 结果
2.1 BfpA在细菌黏附及微绒毛损伤中的作用
经20 d极化培养,TC-7细胞表面可见大量的微绒毛覆盖,微绒毛整齐,致密;EPEC野毒株感染2 h,可见细菌大量紧密黏附在细胞表面,菌落比较致密而扁平,微绒毛变得紊乱并大量脱落;当用ΔbfpA感染时,可见极小量的细菌黏附在上皮细胞表面,上皮细胞微绒毛完整,没有明显微绒毛脱落;当用相应质粒补充BfpA表达以后,突变株恢复到野生型相似的表型(图1)。
2.2 T3SS在细菌黏附及微绒毛损伤的作用
当用EPEC野毒株感染,在15 min时可看见大量细菌黏附在细胞表面,菌落呈球形,成局限性黏附,在感染30 min可观察到细菌仍局限性黏附在细胞表面,但在感染1 h,细菌呈扁平而致密的方式紧密黏附在细胞表面,并且伴随大量微绒毛脱落损伤;而Δcfm-14即使到感染后2 h,细菌仍然成局限性黏附的形式,可以观察到微绒毛略显紊乱,但无显著的微绒毛脱落损伤(图2)。
2.3 外膜蛋白intimin及其受体Tir在细菌黏附及微绒毛损伤中作用
当用Δtir或Δeae删除株感染TC-7细胞,可见:细胞皆局限性黏附在细胞表面,且大量的微绒毛脱落,而EPEC野毒株感染后形成平坦而紧密的菌落;但当用质粒补充Intimin和Tir表达,Δtir或Δeae可以分别恢复到野毒株相似的表型特征(图3)。
2.4 效应分子EspF和Map在黏附及微绒毛损伤中作用
当用ΔespF、Δmap、Δmap espF等删除株感染细胞发现,Δmap能引起与野生型相似的黏附脱落损伤表型,而ΔespF和Δmap espF感染细胞后,可以观察到微绒毛紊乱,而且可以明显观察到细菌嵌入微绒毛丛中,但微绒毛损伤明显比野毒株轻微,当用质粒补充表达EspF后,ΔespF恢复到野生型相似的表型(图4)。
3 讨论
TC-7细胞是从结肠癌Caco-2细胞克隆的一个细胞株,主要用于物质转运、屏障功能和刷状缘微绒毛等研究[4]。EPEC既不产毒素,也不侵袭肠黏膜上皮细胞的肠道致病菌,其致病主要靠其携带的LEE基因编码效应分子转位到宿主细胞引起细胞病变[5]。Cleary等[6-7]报道:细菌的黏附是EPEC感染宿主细胞的第一步,束状菌毛(bundle forming pili,BFP)与细菌黏附高度相关。为了进一步探讨BFP的作用,本研究采用ΔbfpA(删除菌毛的重要亚单位BfpA)感染TC-7细胞。SEM检测发现:该删除株只有少数几个细菌黏附到宿主细胞表面,与野生型EPEC感染形成鲜明对比,当用质粒补充表达BfpA后,恢复了ΔbfpA的表型,充分表明BFP是细菌黏附的重要器官[8],同时表明:BfpA是BFP的重要亚单位结构。
Tir是外膜蛋白Intimin的转位受体,Tir被转位以后,被宿主细胞的蛋白激酶修饰以后插入到宿主细胞的细胞膜,通过其胞外区和Intimin结合,从而细胞紧密黏附到宿主细胞表面[9]。Humberto等[7]和Ferreira等[10]用细胞为模型研究发现:当用Intimin抗体处理细菌以后,细菌的黏附功能显著下降,表明Intimin是细菌的另一个重要的黏附分子,我们用Δtir和Δintimin突变株感染细胞,SEM检测发现两个突变株细菌都可以大量黏附宿主细胞,但呈局限性黏附,意想不到的是:它们引起比野生型更严重的微绒毛脱落损伤,当用质粒补充表达Tir和Intimin以后,Δtir和Δintimin恢复到野生型的紧密黏附表型,表明Tir和Intimin的结合是细菌紧密黏附的关键。对于微绒毛损伤,推测Tir和Intimin的结合起保护作用,与细菌维持持续感染有关系[11],Δtir和Δintimin感染时,由于Tir和Intimin不能结合,反而加重了微绒毛的破坏。当用其它效应分子删除株感染细胞,可以观察到:ΔespF删除株感染时微绒毛损伤明显较野生型引起的轻微,但有大量细菌黏附以及陷入微绒毛丛,但用质粒补充表达EspF以后,ΔespF恢复到野生型的表型,表明EspF在微绒毛的损伤中扮演重要的角色;而Δmap espF双删除株感染组具有和ΔespF删除株感染组相似的表型,而Δmap感染组具有和野生型感染组相似的表型,进一步表明EspF在微绒毛的损伤中其重要作用。关于EspF的研究还发现:EspF可以改变细胞间的紧密连接,破坏细胞的屏障结构[12];EspF还可以定位于宿主细胞线粒体,破坏线粒体功能,从而诱导细胞凋亡[13],这些结果充分表明:EspF是EPEC感染过程中的关键的毒力分子[14]。