解脲棒状杆菌与尿液中磷酸铵镁结晶形成的相关性

李采青， 曹 静， 詹明华， 韩旭颖， 李小凤， 刘金禄

（河北北方学院附属第一医院微生物科，河北 张家口 075000）

解脲棒状杆菌是一种需氧、无芽胞革兰阳性棒状杆菌，是引起泌尿系统感染的重要病原菌。因其迅速分解尿素并利用其生长，导致高氨尿和碱性尿，使尿液中磷酸盐、碳酸磷灰石和尿酸铵等成分过于饱和，从而易产生磷酸铵镁结晶并形成感染性结石。为了解从泌尿系统感染的尿液中分离的解脲棒状杆菌与磷酸铵镁结晶的关系，本研究对用超高倍显微镜观察到磷酸铵镁结晶的尿液进行细菌培养，分析细菌构成，并将解脲棒状杆菌置于无菌、无污染尿液中培养，观察磷酸铵镁结晶情况，以确定其是否影响磷酸铵镁结晶的形成，旨在为临床抗感染治疗、防止感染性结石的形成提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 选取2015年1月—2016年12月来河北北方学院附属第一医院就诊的门诊和住院患者送检至微生物科超高倍显微镜室的尿液样本，其中检出磷酸铵镁结晶阳性尿液46例[患者男31例，年龄（63.29±15.41）岁；女15例，年龄（63.60±12.49）岁]，无磷酸铵镁结晶尿液40例[患者男20例，年龄（44.86±13.75）岁；女20例，年龄（41.64±17.96）岁]。均按要求留取患者中段尿于无菌容器立即送检。解脲棒状杆菌分离自磷酸铵镁结晶尿液。

1.1.2 仪器与试剂 ACT-2000超高倍显微成像系统（上海复星公司）， pH精密试纸（杭州特种纸业有限公司），KDC-40低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），PHONEX100全自动细菌鉴定/药物敏感性系统（美国BD公司），UF-1000i全自动尿有形成分分析仪及配套试剂（日本Sysmex公司）。

1.2 方法

1.2.1 原尿液镜检 取10 mL尿液于离心管中，以400×g离心5 min弃上清，剩余沉渣为0.2 mL，混匀吸取沉渣分别置于2张载玻片上，一张用于直接涂片并做革兰染色，另一张用24 mm×24 mm盖玻片压片，用超高倍显微镜观察全片。

1.2.2 磷酸铵镁结晶阳性尿液细菌培养及鉴定 取10 μL 尿液接种于5%羊血琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，置35 ℃孵箱中培养24～48 h，根据菌落形态、菌落计数、染色特点初步判断，用Phonex100全自动细菌鉴定/药物敏感性系统进行鉴定。

1.2.3 实验菌株在尿液中的培养 将无菌、无污染、无各种结晶、无红细胞和白细胞尿液置于无菌带盖试管中（约2 mL/管），将解脲棒状杆菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和肠球菌分别配制成0.5麦氏浊度菌悬液，分别取10 μL菌悬液加入上述装有尿液的试管中，每份尿液均设立空白对照，置35 ℃孵箱中培养24和48 h。

1.2.4 实验菌株在尿液中培养后的磷酸铵镁结晶镜检 取培养液20 μL于载玻片上，用24 mm×24 mm盖玻片压片，用超高倍显微镜观察结晶形态，保存结晶图像。

1.2.5 结晶显微镜判定 磷酸铵镁结晶有很强的折光性，可见洋信封状、方柱状、立方体、未成形羽毛状等形态。

1.2.6 尿液有形成分的分析 严格按照仪器说明书进行尿液分析。参考区间：pH值5.5～6.5，结晶数量0～10个/μL，细菌0～6 000个/μL，白细胞0～30个/μL。

2 结果

2.1 磷酸铵镁结晶阳性尿液解脲棒状杆菌的阳性率

在46例检出磷酸铵镁结晶的尿液中，细菌培养阳性25例（阳性率54.3%），其中男性患者尿液17例（阳性率54.8%）、女性患者尿液8例（阳性率53.3%）。12例尿液培养出2种病原菌。解脲棒状杆菌8株（阳性率32.0%），其中有2株与肠球菌、1株与大肠埃希菌、1株与白念珠菌混合生长，来自女性1株、男性7株。磷酸铵镁结晶阳性尿液中的细菌种类及构成比见表1。

表1 磷酸铵镁结晶阳性尿液中的细菌种类及构成比

2.2 磷酸铵镁结晶阳性尿液的主要特点

尿液pH值7.0～7.5 7例、8.0～8.5 31例、9.0以上8例；结晶数量在参考区间内35例，＞10个/μL 11例；细菌数量在参考区间内37例，＞6 000个/μL 9例；白细胞在参考区间内11例，＞30个/μL 35例。

2.3 解脲棒状杆菌在尿液中繁殖后形成磷酸铵镁结晶培养液的pH值

空白对照管中尿液的pH值为5.4～7.0，解脲棒状杆菌培养液的pH值均＞9.0。

2.4 解脲棒状杆菌和其他实验菌株在无结晶尿液繁殖后形成磷酸铵镁结晶的情况

对分离的8株解脲棒状杆菌选择其中4株与尿液混合培养后，20例女性患者尿液中有9例（结晶形成率为75.0%），20例男性患者尿液中有15例（结晶形成率为45.0%）有磷酸铵镁结晶形成，4株解脲棒状杆菌在尿液中的磷酸铵镁结晶形成情况和结晶形态均一致。实验菌株磷酸铵镁结晶形成情况见表2。

2.5 解脲棒状杆菌在无结晶尿液中繁殖后磷酸铵镁的结晶形态

表2 实验菌株在无结晶尿液中繁殖后磷酸铵镁结晶形成情况 （例）

解脲棒状杆菌在无磷酸铵镁结晶的尿液繁殖后可观察到方柱状、立方体、未成形羽毛状、洋信封状等结晶形态，以未成形羽毛状多见；同一培养液中可观察到不同形态的磷酸铵镁结晶，48 h后可观察到磷酸铵镁结晶体积变大、变厚且有聚集现象。见图1～图3。

图1 磷酸铵镁洋信封状结晶

图2 磷酸铵镁未成形方柱状结晶

图3 磷酸铵镁未成形立方体结晶

3 讨论

泌尿系统感染是泌尿外科和肾内科常见疾病，临床上常做尿液干化学分析和尿液培养[1]，忽视尿沉渣显微镜镜检。泌尿系统感染分解尿素的病原体后可在尿路中形成磷酸铵镁结晶，磷酸铵镁结晶是尿沉渣检验中常见的结晶之一，正常或病理情况下均可形成，也是形成感染性结石的基础，是泌尿系统感染发生的原因之一[2]。

本研究对超高倍显微镜下观察到磷酸铵镁结晶的尿液进行细菌培养，结果显示细菌阳性率为54.3%，共分离出病原菌9种，具有尿素酶的细菌（解脲棒状杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌）占50%以上。解脲棒状杆菌阳性率为32.0%（8/25），可见在形成磷酸铵镁结晶的泌尿系统感染中解脲棒状杆菌是重要病原菌之一。体外实验显示解脲棒状杆菌在男性或女性患者尿液中生长繁殖时尿液中均有磷酸铵镁结晶形成，48 h男性患者结晶的形成率[75.0%（15/20）]高于女性患者[45.0%（9/20）]，其可能与女性和男性饮食习惯不同有关，这种差异是否真实存在还需要增加样本量或检查尿液中无机盐的浓度加以确定[3]。在由具有尿素酶的奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等引起的泌尿系统感染患者的尿液中均有磷酸铵镁结晶形成，而在由不具有尿素酶的大肠埃希菌和肠球菌引起的泌尿系统感染患者的尿液中没有磷酸铵镁结晶形成或形成较少。本研究结果显示，具有不同产尿素酶能力的细菌在无结晶的尿液中繁殖时其磷酸铵镁结晶的形成能力不相同，解脲棒状杆菌于24 h形成结晶例数最多，随着时间增加例数没有增加，这是由于解脲棒状杆菌具有丰富的尿素酶之故。奇异变形杆菌形成结晶例数次之，铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌形成结晶例数最少，随着繁殖时间的延长形成结晶的例数增加。体外实验结果显示，解脲棒状杆菌在无磷酸铵镁结晶的尿液中繁殖后可见方柱状、立方体、未成形羽毛状、洋信封状等不同形态结晶，随着培养时间的延长，磷酸铵镁结晶体积变大、变厚、聚集，趋向形成结石，可见解脲棒状杆菌在引起泌尿系统感染和感染后形成感染性结石的过程中具有重要作用。正常人尿液中包含有机物和无机物的代谢产物，如尿素、氨基酸、肌酐、尿酸等和Na+、K+、Cl-、PO3-、Mg2+、SO4

2-等，有些物质可作为细菌生长所必须的营养物质和磷酸铵镁结晶形成的无机盐类。解脲棒状杆菌具有丰富的尿素酶，可迅速分解尿素产氨，使尿液pH值增加，以利于细菌生长，尿液在短时间内呈碱性，氨与水结合形成铵离子、碳酸离子，铵与尿中镁离子和磷酸根结合，形成磷酸铵镁结晶以及碳酸磷灰石结晶等，进而形成感染性结石。磷酸铵镁等盐类形成的感染性结石生长比较快、复发率高，给患者带来巨大的痛苦。分离出解脲棒状杆菌的患者多具有男性、高龄、长期留置导尿管的特点，临床应引起重视。老年人排尿不畅，长期留置导尿管或尿路任何部位的狭窄、梗阻、憩室都可使尿液滞留，而尿液滞留继发泌尿系统感染，泌尿系统感染又有利于结石形成[4]。

解脲棒状杆菌是条件致病菌，可引起人体急性膀胱炎、结痂性膀胱炎、溃疡结痂性肾盂肾炎、尿路结石等泌尿系统感染。解脲棒状杆菌在血琼脂平板上生长缓慢，24 h菌落细小或没有形成可见的菌落，在常规细菌培养中容易被漏检。在留取尿液时样本常会受到尿道口快速生长细菌的污染，与其他快速生长细菌和真菌混合感染时，其他细菌迅速生长会掩盖解脲棒状杆菌的生长，这也是在泌尿系统感染病原菌统计结果中很少有解脲棒状杆菌的原因。本研究结果显示有4株解脲棒状杆菌与肠球菌、大肠埃希菌和白念珠菌混合生长。解脲棒状杆菌呈多重耐药[5]，对于特定的人群，如老年、男性以及长期留置导尿管的患者更应重视，积极进行尿沉渣镜检和细菌培养，避免形成持续慢性感染，防止结晶、结石形成，因此临床和实验室应当密切联系，共同提高解脲棒状杆菌的检出率，使患者早日得到正确的诊断和治疗。

吕纯莉等[6]报道影响尿有形成分分析仪检测的因素很多，联合使用尿干化学和尿有形成分分析，也不能完全代替人工显微镜检查。结晶是尿沉渣分析项目之一，但由于磷酸铵镁结晶等结晶不会被染色、大小不等、呈复合多面内部结构，在全自动尿有形成分分析仪常规检验中不能被明确种类。当由具有尿素酶的细菌引起泌尿系统感染时，尿常规显示尿液pH值＞7.0，并含大量白细胞、红细胞、细菌及结晶[7]；解脲棒状杆菌引起感染的尿常规显示尿液pH值≥8.0，白细胞和细菌或结晶阳性。临床和实验室对特定人群应重视尿沉渣镜检和细菌培养，明确磷酸铵镁结晶的存在和细菌种类，积极早期预防或依照药物敏感性试验结果进行抗菌药物治疗，有效控制感染和防止感染性结石的形成。

[1]范宏佳，汤瑾，王坚镪，等. 尿常规检测在尿路感染诊断中的价值[J]．检验医学，2014，29（12）：1207-1211．

[2]高振利，刘庆祚. 泌尿系结石的微创治疗[M]．北京：人民卫生出版社，2011：232-239.

[3]李采青，韩旭颖，曹静，等. 泌尿系感染常见细菌对尿液磷酸铵镁结晶的影响[J]．现代检验医学杂志，2017，32（2）：131-134．

[4]吴在德，吴肇汉. 外科学[M]．7版. 北京：人民卫生出版社，2008：680．

[5]吴玲，魏超君，魏勤，等. 4 例从临床碱性尿液标本中分离的解脲棒状杆菌的鉴定及耐药性分析[J].临床检验杂志，2015，33（7）：557-558．

[6]吕纯莉，肖代敏，朱绍玲，等. URIT-1500尿干化学分析仪与AVE-764B尿有形成分分析仪联合尿液检测复检规则的制定和应用[J]．检验医学，2016，31（1）：45-48．

[7]高逢彬. 泌尿系感染性结石的成因及诊治现状[J]．泌尿外科杂志（电子版），2015，7（4）：51-54．