MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循环CD34+细胞计数的临床价值

董海波， 曾 慧， 张启国， 周 敏， 袁翠英， 陈 兵

（南京大学医学院附属鼓楼医院血液科，江苏 南京 210008 ）

CD34+抗原是唾液酸黏蛋白样Ⅰ型跨膜磷酸糖蛋白，是一种高度糖基化分子，该抗原在人类造血干细胞、祖细胞表面选择表达[1]。如果造血功能稳定，造血干细胞很少在骨髓与外周血循环间交换，但有许多因素可导致骨髓CD34+细胞向外周血循环迁移[1-2]。已有研究结果表明，急性白血病、骨髓纤维化等恶性血液病患者外周血循环CD34+细胞计数存在异常增加现象[3-5]。另有研究结果表明，骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）患者外周血循环CD34+细胞计数不仅存在异常增加现象，而且与疾病危险度分组、染色体核型、国际预后积分系统（the International Prognostic Scoring System，IPSS）预后积分等指标相关。随着研究工作的深入，有学者发现即使疾病在低危阶段，即难治性贫血（refractory anemia，RA）/难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多（refractory anemia with ring sideroblasts，RARS）/难治性贫血伴多系异常（refractory cytopenia with multilineage dysplasia，RCMD）阶段，MDS患者外周血循环CD34+细胞计数亦可出现增加的情况[6-8]。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2009年2月—2015年6月于南京大学医学院附属鼓楼医院血液科就诊的52例MDS患者（男30例、女22例），年龄15～84岁。根据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）MDS诊断标准，所有患者均为MDS-RA/RARS/RCMD。另选取19名造血干细胞供者（男11名、女8名）为正常对照者，年龄22～38岁。

1.2 方法

1.2.1 外周血循环CD34+细胞计数检测 采用FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）进行检测。鞘液使用ISOTON Ⅲ血细胞稀释液（美国Beckman公司）。使用ProCOUNT 试剂盒（美国BD公司，批号为340498），该试剂盒配有核酸染料、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的CD34单抗（抗HPCA22），多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物（peridinin-chlorophyllprotein complex，PerCP）标记的CD45 单抗（抗HLe2l），PE标记的同型对照IgG1。抽取患者、正常对照者静脉血2 mL，运用乙二胺四乙酸管进行抗凝处理。取含有定量荧光微球的TruCOUNT管2支，分别标记为测定（test，T）管、对照（control，C）管。T管中加入核酸染料/CD34 2PE/CD45 2PerCP试剂20 μL，C管中加入核酸染料/IgG1 2PE/CD45 2PerCP试剂20 μL。采用反向加样法，分别加入标本50 μL（应预先对加入标本进行处理，将其有核细胞水平调整为15×109/L左右），混匀，室温、避光染色15 min。加溶血素450 μL，室温、避光放置30 min，旋涡混合器混匀5 s，上机检测，运用ProCOUNT软件分析数据。

1.2.2 染色体检测 取肝素抗凝骨髓5 mL，采用直接法、24 h培养法和同步法制备染色体。采用R带技术显带，描述核型。根据IPSS预后积分，对MDS-RA/RARS/RCMD患者染色体核型进行分组。染色体良好核型组包括正常染色体核型、-Y、5q-、20q-；染色体不良核型组包括复杂染色体核型异常（异常≥3种）、7号染色体核型异常；染色体中间核型组包括除上述2类以外的其他染色体核型异常。

1.2.3 其他检查 所有患者均接受血常规检查、骨髓涂片检查和骨髓活检。

1.3 IPSS预后积分及疾病危险度分组

根据骨髓原始细胞百分比、骨髓造血细胞染色体核型和外周血细胞减少系列数进行计分。0分计为低危，0.5～1.0分计为中危Ⅰ，1.5～2.0分计为中危Ⅱ，≥2.5分计为高危。

1.4 WHO分型预后积分系统（WHO-Based Prognostic Scoring System，WPSS）预后积分及疾病危险度分组

根据WHO亚型、骨髓造血细胞染色体核型和有无输血依赖进行计分。0分计为极低危，1分计为低危，2分计为中危，3～4分计为高危，5～6分计为极高危。

1.5 统计学方法

使用SPSS 17.0软件进行统计分析。采用Pearson χ2检验以及 Fisher精确检验进行统计分析。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MDS-RA/RARS/RCMD患者与正常对照者外周血循环CD34+细胞表达

正常对照者外周血循环CD34+细胞百分比和计数[中位数（范围）]分别为0.04%（0.01%～0.14%）、[1.75（0.90～4.69）]×106/L，MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循环CD34+细胞百分比和计数[中位数（范围）]分别为0.14%（0.01%～7.35%）、[3.01（0.17～208.00）]×106/L。MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循环CD34+细胞百分比和计数均高于正常对照者（p＜0.01）。所有正常对照者外周血循环CD34+细胞计数均＜10.00×106/L。见图1、图2。

2.2 MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循环CD34+细胞计数与临床特点

MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循环CD34+细胞计数与性别、年龄、外周血血细胞减少程度、白细胞计数下降、幼稚前体细胞异常定位（abnormal localization of immature precursor，ALIP）现象均无相关性（r＜0.625，P＞0.05），而与染色体核型异常、IPSS预后积分、WPSS预后积分、骨髓纤维化相关（r＞0.995，p＜0.01）。外周血循环CD34+细胞计数＞10.00×106/L的 MDSRA/RARS/RCMD患者共有16例，其余36例外周血循环CD34+细胞计数＜10.00×106/L。

外周血循环CD34+细胞计数＞10.00×106/L的16例MDS-RA/RARS/RCMD患者中，有12例伴有复杂染色体核型异常（异常≥3种），其中10例伴有7号染色体核型异常；有12例IPSS预后积分为中危Ⅱ；有13例WPSS预后积分为高危； 9例伴有骨髓纤维化。

36例外周血循环CD34+细胞计数＜10.00×106/ L的MDS-RA/RARS/RCMD患者均不伴有复杂染色体核型异常及7号染色体核型异常；所有患者IPSS预后积分均为低危或中危Ⅰ；除1例患者WPSS预后积分为高危外，其余患者的WPSS预后积分均为极低危、低危或中危；除1例患者伴有骨髓纤维化外，其余患者均不伴有骨髓纤维化。见图3。

图1 正常对照者与MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循环CD34+细胞百分比

图2 正常对照者与MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循环CD34+细胞计数

图3 外周血循环CD34+细胞计数与MDS-RA/RARS/RCMD患者临床特点示意图

3 讨论

CD34+抗原主要在人类造血干细胞、祖细胞阶段呈特异性表达。随着造血细胞的不断成熟，CD34+抗原表达逐渐减弱，直至消失。在稳定的造血情况下，该抗原在有核循环血细胞上表达极低，约占未经动员外周血单个核细胞的0.2%[9]。药物诱导的干细胞动员、急性白血病、骨髓纤维化等均可导致骨髓CD34+细胞向外周血循环迁移[10]。

国内外研究工作已证实MDS患者外周血循环CD34+细胞计数存在异常增加现象，而且与疾病危险度分组、不良细胞遗传的出现、白血病相关生存率、IPSS预后积分等具有相关性，是急性白血病的早期信号。当患者处于RA/RARS/RCMD阶段，即“低危”阶段时，其外周血循环CD34+细胞计数往往＜10.00×106/L，而大多数“高危” 难治性贫血伴原始细胞增多（refractory anemia with excess blast，RAEB）阶段的MDS患者外周血循环CD34+细胞计数＞10.00×106/L，且随着疾病危险度的升高，外周血循环CD34+细胞计数亦逐渐增加。当对疾病状态、预后分组进行判断时，外周血循环CD34+细胞计数较CD34+细胞百分比更敏感。KNIPP等[11]研究使用10.00×106/L作为初诊MDS患者外周血循环CD34+细胞计数的临界值，可较好地鉴别疾病“低危”“高危”状态。

对急性白血病，尤其是对急性早幼粒细胞白血病的研究发现，急性早幼粒细胞白血病患者外周血循环CD34+细胞计数均＜10.00×106/L。随着研究工作的深入，有学者发现，部分急性早幼粒细胞白血病患者外周血循环CD34+细胞计数亦可出现＞10.00×106/L的情况，此类患者往往具有一种或多种诸如复杂染色体核型异常、FLT3-ITD基因阳性突变、PML/RARa融合基因复杂融合、高白细胞计数的不良预后因素。当把MDS限定在RA/RARS/RCMD“低危”阶段时，多数MDS患者外周血循环CD34+细胞计数符合既往研究规律，即＜10.00×106/L。部分急性早幼粒细胞白血病RA/RARS/RCMD阶段患者外周血循环CD34+细胞计数可＞10.00×106/L。进一步研究发现该细胞计数的多少与患者性别、年龄、外周血细胞减少程度、白细胞计数下降、ALIP现象均无相关性，而与染色体核型异常、IPSS预后积分、WPSS预后积分、骨髓纤维化等不良预后因素有关[6-8]。

克隆性染色体核型异常是MDS最主要的克隆性造血证据，不仅是MDS的确诊条件之一，还是MDS患者的独立预后因素，不同染色体核型预后分组是确定不同治疗方案的主要依据。复杂染色体核型异常尤其是7号染色体核型异常是MDS的高危预后因素。具有上述染色体核型异常的MDS患者，疾病更易进展，并易向急性白血病转化，常规治疗方案效果差，临床需采取更为积极的治疗策略[12-13]。本研究发现，外周血循环CD34+细胞计数＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者，有75.0%（12/16）伴有复杂染色体核型异常（异常≥3种），并且其中83.3%（10/12）的患者为7号染色体核型异常，并伴有其他染色体核型异常。这一结果表明，MDSRA/RARS/RCMD患者外周血循环CD34+细胞计数＞10.00×106/L提示患者可能具有不良染色体核型，疾病转化为白血病的可能性较大，患者中位生存期短，预后不良。然而，外周血循环CD34+细胞计数未＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者，不伴有复杂染色体核型异常。

近年来，常用IPSS及WPSS对疾病危险度进行分组，并为MDS治疗提供了准确的指导方向。随着预后积分的升高，患者中位生存期及疾病向白血病转化的时间缩短。IPSS预后积分为中危Ⅱ和高危的MDS患者与WPSS预后积分为高危和极高危的MDS患者，往往疾病恶性程度高、预后不良，临床医师应采用更为行之有效的化疗方案[14]。本研究发现外周血循环CD34+细胞计数＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者中分别有75.0%（12/16）及81.3%（13/16）的患者IPSS预后积分为中危Ⅱ及WPSS预后积分为高危，而外周血循环CD34+细胞计数未 ＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者IPSS预后积分均为低危或中危Ⅰ，除1例WPSS预后积分为高危外，其余患者的WPSS预后积分均为极低危、低危或中危。

MDS患者除了有骨髓病态造血的情况外，还可能伴有骨髓纤维化。MDS伴有骨髓纤维化是疾病的独立不良预后因素[15]。本研究发现52例MDS-RA/RARS/RCMD患者10例伴有骨髓纤维化，其中9例患者外周血循环CD34+细胞计数 ＞10.00×106/L，而外周血循环CD34+细胞计数未＞10.00×106/L的患者仅有1例伴有骨髓纤维化。

综上所述，MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循环CD34+细胞计数可出现异常增加，外周血循环CD34+细胞计数＞10.00×106/L的患者多伴有复杂染色体核型异常，疾病危险度高，预后不良。外周血循环CD34+细胞计数检测方便、简单，患者痛苦小，有助于对MDS患者疾病危险度的进一步分层，具有一定的临床实用价值。

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