运用CLSI EP7-A2文件评价溶血对血糖检测的影响

沈建江， 符布清， 赵 春， 徐 天

（江苏省中医院检验科，江苏 南京 210029）

目前，溶血样本占不合格样本总量的60%左右，是临床实验室退回样本的主要原因[1-2]。但对一些特殊情况的检查，如葡萄糖耐量试验，由于其抽血时间有着严格的规定，餐后每次样本都是唯一且不可替代的。虽然现在临床常用的己糖激酶（hexokinase，HK）法有着良好的抗溶血干扰能力，但一旦溶血程度严重，极有可能造成结果的不准确。在美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP7-A2文件中，有2种干扰评价方案（配对差异实验和剂量效应实验）可供使用。将潜在的干扰物质添加至检测样本中，评价其相对于未加干扰物质的对照组的偏移，即配对差异实验。若引起的偏移有显著临床意义，则为干扰物质，应进一步评价，证实干扰程度与干扰物浓度的关系，即剂量效应实验。本研究采用CLSI EP7-A2文件中的2种干扰评价方案确定溶血对葡萄糖（glucose，Glu）测定是否有干扰以及溶血达到什么程度会对结果产生干扰，进而给临床医生提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集江苏省中医院体检当天无黄疸、溶血、脂血的剩余血清样本，制备成混合血清，Glu浓度高值为11.1 mmol/L、中值为7.0 mmol/L。

1.2 仪器与试剂

AU5800全自动生化分析仪（美国Beckman-Coulter公司）。葡萄糖测定试剂盒（HK法，批号1216071）、校准品（批号0417021）购自四川迈克生物科技股份有限公司，质控品购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。检测前仪器情况良好，用校准品校准Glu项目，并且质控在控。

1.3 干扰物贮存液配制[3]

依据CLSI EP7-A2文件要求，制成100 g/L血红蛋白（hemoglobin，Hb）贮存液。

1.4 配对差异实验

1.4.1 样本制备 （1）基础样本：取Glu浓度为7.0、11.1 mmol/L的血清作为基础样本；（2）测试样本和对照样本：基础样本以19︰1的比例稀释Hb溶液作为测试样本，稀释后测试样本的Hb浓度为5 g/L。以生理盐水作为对照样本。

1.4.2 检测次数的计算 计算出允许的最大干扰值（dmax）/批内标准差（s）的值，利用dmax/s与检测次数对应表[3]得出2个浓度的检测次数。s由基础样本连续测定20次计算得出，dmax为美国临床实验室改进修正法规（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988，CLIA'88）规定的允许误差的1/3，定义为T±3.33%。

1.4.3 检测要求 为避免携带污染，增加额外样本Cx（去离子水），按如下顺序检测：C1T1CxCxC2T2CxCx……CxCxCnTn，其中C为对照样本、T为测试样本。

1.4.4 干扰效应评估 计算出dobs（测试样本均值-对照样本均值），与甄别值dc比较，若dobs≥dc，则存在干扰。dc在双侧检验时可通过公式计算得出：dc=（dnull+sZ1-α/2）式中dnull是无效假设规定的值，通常为0；s为批内标准差，Z1-α/2是从相应的标准正态分布到双侧检验中100（1-α）%的可信区间水平，n为重复测定次数。

1.5 剂量效应试验

1.5.1 样本准备 （1）干扰物高浓度（H）及低浓度（L）样本：样本制备方式同配对差异实验；（2）测试样本：按照L、3/4L+1/4H、1/2L+1/2H、2/4L+3/4H、H进行配制。

1.5.2 测定次数 共测定3次，第1次由低浓度到高浓度，第2次由高浓度到低浓度，第3次由低浓度到高浓度。

1.5.3 剂量效应分析 （1）线性效应：如果数据成一条直线，可进行线性回归分析，在图上绘制回归线；（2）非线性效应：若各浓度在作图时显示非线性，利用非线性回归评估干扰物的干扰浓度。

2 结果

2.1 配对差异试验

2.1.1 重测次数的确定 中、高浓度基础样本20次测定的Glu均值分别为6.95、 10.88 mmol/L，dmax分别为0.23、0.36 mmol/L，s分别为0.044、0.105 mmol/L。中、高浓度Glu的dmax/s均＞3，测定次数均为3次。

2.1.2 干扰效应分析 中、高浓度Glu的dobs分别为0.77、0.93 mmol/L，dc分别为0.05、0.12 mmol/ L，dobs均＞dc，表明5 g/L Hb对Glu测定存在干扰。

2.2 剂量效应实验

依据剂量反应干扰测试程序[3]，Hb对Glu测定产生非线性正干扰，见表1。中浓度Glu的非线性方程为Y=6.496+0.160 5X-0.013 10X2（r2=0.983）；高浓度Glu的非线性方程为Y=10.13+0.211 0X-0.017 83X2（r2=0.973），见图1、图2。

表1 Hb对Glu检测的干扰剂量效应结果

图1 Hb对中浓度Glu干扰的剂量效应图

图2 Hb对高浓度Glu干扰的剂量效应图

3 讨论

由于居民生活水平的不断提高，我国的糖尿病患病率已跃居全世界第2位，其发病率和死亡率呈持续增长趋势[4-5]。很多糖尿病患者 “三多一少”症状并不明显，因此初期诊断是当前防治糖尿病的难点与重点。糖耐量减低是糖尿病的最早期阶段。临床诊断糖尿病都从筛查糖耐量减低开始。目前，临床常用口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）监测空腹及餐后血糖，但由于需多次、不同部位采血，容易因抽血不畅而导致样本溶血。OGTT在不同时间点的采血有严格的定义，一旦出现样本溶血，退回重采的可能性很低。因此，溶血对Glu测定的影响，尤其是在医学决定水平处的偏差可能会导致临床医生误判病情。

本研究采用CLSI EP7-A2文件分析了溶血对Glu测定结果的影响。结果显示5 g/L Hb对Glu测定有明显正干扰，可能与溶血导致的Hb干扰或细胞内容物释放有关[6]。Hb在主波长340 nm处有明显的吸收峰，会干扰速率法中的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸检测系统[7]。本研究结果显示，随着Hb浓度的增加，Glu的结果也呈假性增高。为避免该情况引起临床医生对患者病情的误判，我们利用AU5800全自动生化分析仪的溶血指数测定功能，判断样本的溶血程度。AU5800全自动生化分析仪的溶血指数标记如下：N为Hb＜0.50 g/ L，+为0.50 ～0.99 g/L，++为1.00～1.99 g/L，+++为2.00～2.99 g/L，++++为3.00～5.00 g/ L，+++++为＞5.0 g/L。依据本研究定义的dmax（T±3.33%），中、高浓度Glu允许的检测结果上限均处于Hb 1.25～2.5 g/L之间，即溶血指数++及以上的样本，其Glu检测结果均不可接受。由于肉眼判断溶血及溶血程度与仪器测定的溶血指数往往有着明显的差异[8]，因此检验工作人员发出报告时应充分利用仪器的溶血指数功能，在报告单上明确说明样本的溶血程度，当溶血为++及以上时，应在检测报告上注明结果偏高，数值仅供临床参考。

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