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HPLC法测定克白酊中补骨脂素、异补骨脂素和盐酸异丙嗪的含量*

2018-05-22刘云云马晓昱程艳芹

实用医药杂志 2018年2期
关键词:异丙嗪补骨脂素药典

高 媛,孙 旭,刘云云,马晓昱,程艳芹,陈 瑶

白癜风是一种常见的后天性局限性或泛发性皮肤色素脱失病,由于皮肤的黑素细胞功能消失引起,机制尚不清楚。海军官兵急性和长期暴露于太阳光,阳光中超强的紫外线所致光毒性反应、光变态反应,皮肤中产生大量的自由基,如单线态氧、过氧化氢和氮等,使黑色素细胞受损或转运发生障碍,可致白癜风的发生率增高。药物治疗有激素类、免疫调节剂、大剂量维生素等,但效果多不佳。克白酊是解放军第401医院研制,以补骨脂为主药,红花、荆芥、盐酸异丙嗪等组成的复方制剂,具有温经活血,软坚透络的作用,用于治疗白癜风并取得良好的治疗效果。为了进一步完善该品种的质量标准,该研究建立HPLC测定克白酊中补骨脂素、异补骨脂素[1]和盐酸异丙嗪[2]含量的方法,操作简单,结果准确,重现性好,能有效控制该制剂质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ZF-6型三用紫外分析仪;METTLER AE240电子天平;岛津LC-20AT高效液相色谱仪;AS-B超声波清洗仪;HG-B电热恒温干燥箱。

1.2 试药 甲醇为色谱纯;对照品补骨脂素(批号110739-201115,中国食品药品检定所,纯度:99.3%)、异补骨脂素(批号110738-201313,中国食品药品检定所,纯度:100.0%)、盐酸异丙嗪(批号 100422-201002,中国食品药品检定所,纯度:99.4%);克白酊(批号 20140910、20140911、20140912)。

2 方法与结果

2.1 补骨脂素和异补骨脂素的含量测定[1,3]

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水(52∶48)为流动相;检测波长为246 nm,柱温为25℃;流速1.0 ml/min;补骨脂素峰保留时间为5.926 min,分离度为1.749,理论板数为3026;异补骨脂素峰保留时间为7.965 min,分离度为2.043,理论板数为3595。阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图见图1A,1B,1C和 1D。

图1 阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图

2.1.2 对照品溶液的制备 分别取补骨脂素和异补骨脂素对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 ml含补骨脂素1.819 mg的对照品溶液和每1 ml含异补骨脂素1.704 mg的对照品溶液(对照品储备液),精密量取适量于容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,即得40 μg/ml的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取克白酊20 ml,蒸干,残渣加入甲醇50 ml,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液25 ml置于50 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

2.1.4 阴性对照品溶液的制备 取缺补骨脂的样品,按“2.1.3”项下方法制备成阴性对照品溶液。

2.1.5 标准曲线的绘制 分别取“2.1.2”项下补骨脂素、异补骨脂素对照品储备液适量,以甲醇为溶剂稀释,得系列标准溶液。含补骨脂素和异补骨脂素为 10、20、40、80、100 μg/ml,分别取 20 μl注入液相色谱仪,记录色谱图。以峰面积值为纵坐标(Y),浓度(μg/ml)为横坐标(X)绘制标准曲线。计算得补骨脂素回归方程:Y=16525X+29868,R2=0.9999;异补骨脂素回归方程:Y=15873X+44765,R2=1,实验表明补骨脂素和异补骨脂素在10~100 μg/ml的范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.1.6 精密度试验 分别精密吸取 “2.1.5”项下40 μg/ml补骨脂素和异补骨脂素对照品溶液20 μl,按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次,记录峰面积值,计算RSD分别为0.13%和0.10%。说明仪器的精密度良好。

2.1.7 重现性试验 取克白酊(批号20140912),按“2.1.3”项下方法分别制备6份供试品溶液,分别进样20 μl,记录补骨脂素和异补骨脂素峰面积值,计算RSD(n=6)分别为0.80%和1.76%,表明方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 取克白酊(批号20140912),按“2.1.3”项下方法配制供试品溶液,分别于0,2,4,6,8,12 h 进样 20 μl,按“2.1.1”项下色谱条件,测定补骨脂素、异补骨脂素的峰面积,计算RSD分别为2.11%和2.40%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.9 加样回收率试验 取已知含量的克白酊样品(批号20140912)12份,在线性范周内分别加入一定量的补骨脂素、异补骨脂素对照品溶液各6份,按“2.1.1”项下色谱条件测定,结果详见表1、表2。说明本方法回收率良好。

2.1.10 样品含量测定 按“2.1.1”项下色谱条件,分别精密吸取“2.1.2”“2.1.3”项下溶液各 20 μl,按照 2015 年版《中国药典》四部 0512[3]),进样 3 批克白酊样品(批号 20140910、20140911、20140912),每批样品测定3份,以外标法计算各个样品中补骨脂素和异补骨脂素的含量,结果详见表3。

2.2 盐酸异丙嗪的含量测定[2,3]

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水(用冰醋酸调节pH 至 2.3)(45∶55)为流动相;检测波长为 254 nm,柱温为25℃;流速1.0 ml/min;盐酸异丙嗪峰保留时间为 9.918 min, 分离度为 1.544, 理论板数为2223。阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图见2A,2B和2C。

表1 补骨脂素加样回收率试验测定结果

表2 异补骨脂素加样回收率试验测定结果

表3 克白酊样品中补骨脂素和异补骨脂素含量(mg/100 ml)测定结果(n=2)

图2 阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图

2.2.2 对照品溶液的制备 取盐酸异丙嗪对照品适量,精密称定,加0.1 mol/L盐酸溶液制成每1 ml含盐酸异丙嗪1.056 mg(对照品储备液),精密量取适量于容量瓶中,加0.1 mol/L盐酸溶液至刻度,摇匀,即得20 μg/ml的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取克白酊40 ml,蒸干,残渣加入0.1 mol/L盐酸溶液50 ml,称定重量,超声处理 30 min,放冷,再称定重量,用 0.1 mol/L盐酸补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液10 ml置100 ml量瓶中,用0.1 mol/L盐酸稀释至刻度,摇匀,即得。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 取缺制盐酸异丙嗪的样品,按“2.2.3”项下方法制备成阴性对照品溶液。

2.2.5 标准曲线的绘制 取“2.2.2”项下盐酸异丙嗪对照品储备液适量,以0.1 mol/L盐酸为溶剂稀释,得系列标准溶液。含盐酸异丙嗪为10、20、40、60、80 μg/ml,分别取 20 μl注入液相色谱仪,记录色谱图。 以峰面积值为纵坐标(Y),浓度(μg/ml)为横坐标 (X)绘制标准曲线。计算得回归方程,Y=94716X-13730,R2=0.9994。 实验表明盐酸异丙嗪在10~80 μg/ml的范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取“2.2.5”项下 20μg/ml盐酸异丙嗪对照品溶液 20 μl,按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次,记录峰面积值,计算RSD为1.04%。说明仪器的精密度良好。

2.2.7 重现性试验 取克白酊(批号20140912),按“2.2.3”项下方法分别制备 6 份供试品溶液,分别进样20 μl,记录盐酸异丙嗪峰面积值,计算 RSD(n=6)为 1.52%,表明方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取克白酊(批号20140912),按“2.2.3”项下方法配制供试品溶液,分别于 0,2,4,6,8,12 h 进样 20 μl,按“2.2.1”项下色谱条件,测定盐酸异丙嗪的峰面积,计算RSD为2.82%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的克白酊样品(批号20140912)6份,在线性范周内分别加入一定量的盐酸异丙嗪对照品溶液,按“2.2.1”项下色谱条件测定,结果详见表4。回收率良好。

表4 盐酸异丙嗪加样回收率试验测定结果

2.2.10 样品含量测定 按“2.2.1”项下色谱条件,分别精密吸取 “2.2.2”“2.2.3” 项下溶液各 20μl,照2015 年版《中国药典》四部 0512[3]),进样 3 批克白酊样品(批号 20140910、20140911、20140912),每批样品测定3份,以外标法计算各个样品中盐酸异丙嗪的含量,结果详见表5。

表5 克白酊样品中盐酸异丙嗪含量(mg/100 ml)测定结果(n=2)

3 讨论

克白酊是由补骨脂为主药,红花、荆芥和盐酸异丙嗪等组成的复方制剂,《中国药典》记载其外用可以消风祛斑。该制剂在中药之中添加了少量化学药盐酸异丙嗪,盐酸异丙嗪为H1受体拮抗药,具有抗过敏和镇静作用。因此,笔者采用HPLC法对方中补骨脂主要活性成分补骨脂素和异补骨脂素[1,3-5]以及盐酸异丙嗪[2,3,6,7]的含量进行测定。补骨脂素和异补骨脂素在246 nm波长有最大吸收,因此该波长作为其检测波长;用流动相稀释盐酸异丙嗪后进行紫外扫描,其最大吸收在254 nm,故选择254 nm为盐酸异丙嗪含量测定的检测波长。实验表明,在分别设定的色谱条件下,克白酊中的补骨脂素、异补骨脂素和盐酸异丙嗪与相邻色谱峰能有效分离,样品含量稳定。

该方法操作简单,专属性强,重现性较好,结果准确等优点,可作为克白酊的质量标准,控制本品的质量。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].2015年版.北京:中国医药科技出版社,2015:187.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].2015年版.北京:中国医药科技出版社,2015:969.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[S].2015年版.北京:中国医药科技出版社,2015:59-61.

[4]付前霞.益肾灵颗粒中补骨脂含量测定的研究[J].临床合理用药,2011,10(4B):100-101.

[5]张婷,龚志成,唐芬芬.补骨脂微乳液中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定[J].医药导报,2012,31(12):1619-1621.

[6]陈晓峰,张卫.HPLC测定消炎止痛醑中盐酸异丙嗪的含量[J].北方药学,2012,9(8):2-3.

[7]蔡涛.HPLC法同时测定氨酚异丙嗪注射液种对乙酰氨基酚与盐酸异丙嗪的含量[J].中国药品标准,2012,13(6):441-461.

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