生产设备清洁验证残留物盐酸米那普仑的HPLC法测定

吴青一

摘 要 目的：建立清洁验证中残留物盐酸米那普仑含量测定的高效液相色谱法。方法：色谱柱为Diamonsil C18（4.6 mm×150 mm，5 mm），流动相为 0.2%十二烷基磺酸钠溶液-乙腈（50∶50，含0.1%三乙胺），用磷酸调至pH 3.8，检测波长210 nm，流速0.6 ml/min，柱温30 ℃，进样体积10 ml。结果：盐酸米那普仑在0.65～2.59 mg/ml范围内线性关系良好，相关系数r=0.999 5，平均回收率为76.83%，RSD=5.23%（n=18）。结论：该方法操作简便、快速，结果准确，可用于清洁验证残留物盐酸米那普仑的定量分析。

关键词 高效液相色谱法 盐酸米那普仑 清洁验证 定量限 检测限

中图分类号：TQ460.5 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2018）05-0077-04

Determination of milnacipran hydrochloride residues in cleaning validation by HPLC

WU Qingyi*

（Shanghai Shyndec Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200137， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of milnacipran hydrochloride residues in the cleaning validation by HPLC. Methods： HPLC was carried out on a Diamonsil C18 column （4.6 mm×150 mm， 5 μm） with a mixture of 0.2% sodium dodecyl sulfonate- acetonitrile （50：50， containing 0.1% triethylamine） as the mobile phase （pH 3.8 adjusted with phosphoric acid）， at the detection wavelength of 210 nm， the flow rate of 0.6 ml/min， the column temperature of 30 ℃ and the injection volume of 10 μl. Results： The standard curve of milnacipran hydrochloride showed a good linear relationship over the range of 0.65 to 2.59 μg/ml with the correlation coefficient （r） of 0.999 5. The average recovery of samples was 76.83% with RSD of 5.23% （n=18）. Conclusion： This method is convenient， quick and accurate， and suitable for the quantitative determination of milnacipran hydrochloride residues in the cleaning validation.

KEY WORDS HPLC； milnacipran hydrochloride； cleaning validation； limit of quantitation； limit of detection

鹽酸米那普仑是一种新型特异性的5-HT和NE再摄取双重抑制剂，临床上不仅可以用于抑郁症的急性期治疗和维持期治疗，还可以用于治疗中风后抑郁、脑外伤后抑郁以及慢性疼痛综合征，且无三环类药物常见的嗜睡和抗胆碱能作用，恶心和呕吐等胃肠道不良反应较选择性5-羟色胺再摄取抑制剂类药物（SSRIs）少见，是一种十分有前景的抗抑郁药[1]。其制剂盐酸米那普仑片是本公司开发，目前与其他产品共线生产。为确保不造成交叉污染、降低本品的生产对其他产品造成的质量风险，提高药品的安全性，需要对生产用设备进行有效清洗。本研究根据药品GMP要求，通过计算，确定盐酸米那普仑片清洁验证设备残留限度为0.32 mg/cm2 [2-3]。残留物分析方法的可靠性是清洁验证的重要保障[4]，因此，必须对残留物的分析方法进行验证。本研究参考中国药典要求[5]和盐酸米那普仑片质量标准中含量测定方法[6]，建立了残留物盐酸米那普仑的HPLC分析方法，并对每个验证参数设立了可接受标准。通过方法验证，确定该方法能保证清洁验证的准确性，可用于该产品清洁验证中残留物的检测及定量分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XS205电子分析天平（瑞士Mettler公司）；盐酸米那普仑对照品（批号：P302-1603001，含量：100.0%，上海现代制药股份有限公司）；无水乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（HPLC纯，美国默克公司）；十二烷基磺酸钠（AR，日本东京化成工业株式会社）；三乙胺、磷酸（HPLC纯，美国Tedia公司）。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18 （4.6 mm×150 mm，5 mm；北京迪马科技有限公司）；流动相为 0.2%十二烷基磺酸钠溶液-乙腈（50∶50，含0.1%三乙胺），用磷酸调pH至3.8； 检测波长210 nm，流速0.6 ml/min，柱温30 ℃，进样体积10 ml。

1.2.2 溶液配制

1）对照品贮备液 精密称取盐酸米那普仑对照品32 mg，加水溶解并稀释至200 ml，作为对照品贮备液（160 mg/ml）。

2）对照品溶液 精密量取对照品贮备液1.0 ml，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液（1.6 mg/ml）。

3）空白棉花浸出液 用镊子夹取医用脱脂棉两小团，用乙醇润湿后放入10 ml具塞试管中，加入5 ml 纯化水，超声5 min，放置10 min，不时振摇，取上清液即得。

4）线性试验用溶液 分别精密量取对照品贮备液0.4、0.7、1.0、1.3和1.6 ml，置100 ml量瓶中，用纯化水稀释至刻度，摇匀，即得。

5）回收率试验用溶液 精密量取对照品贮备液5.0 ml，置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，即得。

1.2.3 不锈钢板擦拭取样

在一块面积为25 cm×25 cm的平整光洁的不锈钢板上用钢锥每隔5 cm划线，形成25块5 cm×5 cm的正方块。精密量取回收率试验用溶液0.1 ml均匀地滴加在不锈钢板中间的1个正方块上，用电吹风吹干，按图1方法用棉签擦拭各个方块。

用鑷子夹取一小团脱脂棉花，先用无水乙醇润湿，并将其靠在溶剂瓶上以除去多余的无水乙醇。将棉团平稳而缓慢地擦拭取样表面（面积为5 cm×5 cm）。在向前移动的同时将其从一边移动到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面。翻转棉团，让棉团的另一面也进行擦拭，但与前次擦拭移动的方向垂直（图1）。擦拭好的棉团立即放入10 ml的具塞试管中，另取一新的用无水乙醇润湿的棉团，将方块中残留的溶液擦拭干净，放入同一10 ml具塞试管中，加入5 ml 纯化水，超声5 min，放置10 min，不时振摇，作为供试品溶液。

2 结果

2.1 专属性试验

精密量取空白棉花浸出液和对照品溶液各10 ml进行液相色谱分析，结果表明，空白棉花浸出液在盐酸米那普仑峰位置无杂质峰（图2中保留时间5.522 min），对盐酸米那普仑残留测定无干扰。

2.2 系统精密度试验

根据擦拭取样限度0.32 mg/cm2计算可知，供试品溶液的检出限度应为1.6 mg/ml。故采用对照品溶液（1.6 mg/ml）进行系统精密度试验。精密量取对照品溶液10μl，连续进样5次进行液相色谱仪分析，峰面积分别为85 358、85 305、85 277、85 027、85 228，平均峰面积为85 239，RSD为0.16%（应≤1.5%），理论塔板数为9 886（应≥8 000）。表明系统重复性良好，系统适用性符合规定。

2.3 线性关系试验

精密量取5个浓度的线性试验用溶液各10 ml进行液相色谱仪分析，其测定值分别为0.647 2、1.132 6、1.618 0、2.103 4、2.588 8 mg/ml。以浓度X为横坐标，以盐酸米那普仑峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程Y = 54 046X- 1 328，相关系数r为0.999 5。结果表明，在0.65～2.59 mg/ml浓度范围内其线性关系良好（图3）。

2.4 检测限和定量限

将0.64 mg/ml线性试验用溶液用纯化水不断稀释，精密量取10 ml进行液相色谱仪分析。根据信噪比法，分别以信噪比（S/N）10∶1和3∶1得出盐酸米那普仑的定量限为12.8 ng/ml，检测限为6.4 ng /ml。

2.5 擦拭取样法回收率

由一个取样人员平行擦拭3组，每组6份，精密量取上述供试品各10 μl进行色谱分析，按外标法以峰面积计算供试品中盐酸米那普仑的残留量。三组平均回收率为76.83%（应≥50%），RSD为4.45%（应≤20%），符合规定（表1）。盐酸米那普仑片清洁验证设备残留限度的测定限值应为“盐酸米那普仑残留量限值×回收率”，为确保安全，按最严格要求该回收率应为三组平均回收率的最小值74.11%，故测定限值为0.24 mg/cm2。

2.6 溶液的稳定性

于0、2、4、6、8、10、12、14和16 h各取供试品溶液10 ml进行液相色谱仪分析，以不同进样时间（溶液放置时间）主峰面积的变化情况来确定供试品溶液的稳定性。结果表明，供试品溶液放置16 h内稳定，其主峰面积的RSD为0.33%（应≤2.0%）（图4）。

3 讨论

设备清洁验证是制药企业生产过程中防止共线产品交叉污染、生产稳定可控，药品质量安全可靠，确保患者用药安全的重要手段之一。清洁验证中，影响验证结果的因素众多，如清洁规程的评估、产品评估、设备评估、目标化合物的选择、检验方法的选择和评估等等[7-8]，而其中，采用经过验证的分析方法，是保证分析结果真实可靠的前提条件[9]。

用HPLC法进行清洁验证的要求不同于成品检验，要尽快出峰，以配合清洁操作的完成[10]。本试验参照盐酸米那普仑片的含量测定方法，选用150 mm长的短柱，使得主峰出峰时间提早到5～6 min，有利于生产线清洗完成后立即取样检测。相对于文献方法[11-13]，本法简便、快速， 结果准确，可用于清洁验证中盐酸米那普仑残留物的定量分析。

本研究取样回收率试验虽然符合规定，但结果偏低，故还应该予以关注。因为不同的设备材质，设备表面的平滑程度以及不同的擦拭力度，对采样结果会有不同程度的影响[14]。因此在设备清洁验证中应由方法验证进行回收率试验时的取样人员采用同等力度进行擦拭取样，如更换取样人员，应重新进行相应的方法擦拭回收率试验。同时当情况发生改变时如分析仪器的改变，生产工艺的改变，或清洁规程的改变等，都有可能影响原分析方法的准确性，故清洁验证的分析方法需进行再验证[9]。

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