FQ-PCR法与细菌培养法检测妊娠晚期B族链球菌感染的效能比较及细菌耐药性分析

杨洁 陈海迎 郑建琼 陈晶晶 黄志琼 朱雪琼

B 族链球菌（group B streptococcus，GBS）又称无乳链球菌，是一种革兰阳性兼性厌氧菌，常定植于女性下生殖道和肠道[1]。妊娠晚期GBS感染可引起胎膜早破、早产、羊膜腔感染等不良妊娠结局，另外，GBS还可以通过羊水或在分娩过程中经产道垂直传播[2]，引起新生儿GBS感染，主要表现为肺炎、败血症和化脓性脑膜炎[3-4]。围生期GBS感染对母婴健康危害极大。据统计，欧美国家孕妇GBS感染率约10%～30%，而其中40%～70%通过生殖道垂直传播给新生儿[5]。细菌培养法是GBS检测的金标准，但耗时较长，且灵敏度较低，2010年最新的美国疾病控制与预防中心（CDC）GBS防治指南推荐对孕35～37周的孕妇进行阴道联合直肠GBS的筛查，并指出可以使用荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）法对GBS进行筛查[6]。本研究旨在探讨FQ-PCR法和细菌培养法在妊娠晚期GBS感染检测中的应用价值，并分析其耐药性，为GBS的产前筛查和防治工作提供理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年2月1日至2017年1月31日于温州市人民医院产前检查并住院分娩的961例孕妇作为研究对象。纳入标准：（1）单胎妊娠；（2）孕 35～37 周时进行GBS带菌状况检查；（3）取样前1周内无性生活、阴道用药及抗生素使用史。（4）经医院伦理委员会批准和患者知情同意。排除标准：（1）合并严重心血管、肝、肾及免疫系统疾病；（2）合并其他生殖道感染者(细菌性阴道病、外阴阴道假丝酵母菌病、滴虫性阴道炎、支原体、衣原体感染)；（3）产前明确胎儿畸形或死胎需引产者。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 首先将孕妇外阴分泌物擦拭干净，2根无菌尼龙拭子小心插入阴道内，在阴道下段1/3处旋转一周采集阴道分泌物，之后将拭子插入肛门，于肛门括约肌上缘2～3cm处轻轻旋转一周采集直肠分泌物。标本采集完成后1h内送实验室，24h内检测，1个拭子用于PCR检测，另1个用于细菌培养。

1.2.2 FQ-PCR法 PCR试剂盒购自博尔诚(北京)科技有限公司，实时荧光定量核酸扩增仪（C1000型）购自美国Bio-Rad公司。所有检测过程及结果判读严格按照操作说明进行。该方法是通过临床收集到产妇分泌物，进行细菌DNA提取，在PCR技术平台上，针对GBS基因组特异且无高频单核苷酸多态性位点的序列区域环磷酸腺苷（CAMP）因子，设计出特异引物和探针，配以全封闭PCR体系，检测标本中的GBS DNA。体系中通过加入内参照系统排除PCR过程中可能的假阴性结果，并通过加入UNG避免可能的扩增污染物造成的假阳性结果。

1.2.3 细菌培养法 将阴道直肠分泌物标本放入5%羊血培养基里，置于CO2培养箱内恒温（35℃）培养18～24h。再把可疑的灰白色、圆形细菌挑选出来，做涂片进行革兰染色镜检，镜下革兰阳性球菌呈链状排列，触酶试验阴性，CAMP试验阳性，初筛为GBS，再上机（VITEK2）检测确认。

1.2.4 分析内容 妊娠晚期孕妇GBS带菌状况、FQPCR法与细菌培养法检出率。以FQ-PCR法联合细菌培养法为金标准，分别计算2种方法的灵敏度、特异度、约登指数、阴性似然比，比较2种检测方法的检验效能。根据细菌培养的药敏试验结果，分析GBS对13种抗菌药物（青霉素G、替加环素、利奈唑胺、氨苄西林、万古霉素、喹奴普汀-达福普汀、克林霉素、呋喃妥因、环丙沙星、莫西沙星、左旋氧氟沙星、氯洁霉素及四环素）的耐药情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FQ-PCR法与细菌培养法检出率比较 961例孕妇中2种检测方法共检出GBS感染者103例，妊娠晚期孕妇GBS检出率为10.7%（103/961）。其中FQ-PCR法检出GBS阳性100例，检出率为10.4%（100/961）；细菌培养法检出GBS阳性33例，检出率为3.4%（33/961）；2 种方法检出率比较差异有统计学意义（χ2＝63.23，P＜0.01）。

2.2 FQ-PCR法与细菌培养法检验效能比较 以FQPCR法联合细菌培养法为金标准，FQ-PCR法检测的灵敏度、特异度、约登指数、阴性似然比分别为0.98、1.00、0.98、0.02，细菌培养法检测的灵敏度、特异度、约登指数、阴性似然比分别为 0.32、1.00、0.32、0.68，FQ-PCR 法检测的灵敏度优于细菌培养法，差异有统计学意义（χ2＝61.35，P＜0.05），

2.3 GBS对抗菌药物的耐药分析 33例GBS菌株的抗菌药物敏感试验显示，GBS对青霉素G、替加环素和利奈唑胺的敏感性为100.0%；对氨苄西林和万古霉素的敏感性较高，分别为97.0%和93.9%；对氯洁霉素和四环素的敏感性较低，分别为39.4%和24.2%。GBS对克林霉素、喹诺酮类、氯洁霉素和四环素的耐药率较高，见表1。

3 讨论

GBS是导致围生期感染的重要致病菌[7-8]，西方发达国家对妊娠期GBS感染做了大量研究，美国CDC于1996、2002、2010年先后3次颁布并修订了围生期GBS防治指南，推荐对孕35～37周的孕妇常规开展GBS筛查[6]。国内报道围生期GBS的感染率为10.1%～32.4%[9-11]，差异较大，这与我国未全面开展孕妇GBS的筛查以及GBS检测方法、试剂和诊断标准的不统一有关。本研究发现妊娠晚期孕妇生殖道GBS定植率为10.7%，与前人的研究相近，但仍有待大样本、多中心的研究进一步了解我国妊娠期妇女GBS感染的现状。

表1 33例GBS菌株对抗菌药物的耐药分析[例（%）]

目前常用的GBS检测方法有细菌培养、PCR、核酸探针检测、免疫原位杂交等。细菌培养法是检测GBS感染的金标准，也是国内大多数医院首选的检测方法。但是细菌培养一般需24～48h，耗时长[12]，对于早产、胎膜早破以及未正规产前检查的孕妇，可能由于检测时效问题，以致用药不及时，造成新生儿感染的风险增加。此外，细菌培养法检出率低[13]，可能受到多种因素影响：（1）阴道和直肠的其他细菌生长抑制GBS的繁殖，导致细菌量不足，使得培养难度增加，甚至出现假阴性的结果；（2）标本取材后受保存条件、环境温度等因素的影响，GBS有部分死亡的可能，从而出现漏诊现象。应用PCR技术来检测GBS是近年来的研究热门，其优点是快速、敏感、可批量操作，核酸提取后只需2～4h便能得到检测结果，并且可以检测到死亡的GBS[14]，实现了GBS的快速高效筛查。有研究报道细菌培养法的阳性率只有 5.2%、7.5%[15-16]，而 PCR 法敏感性为 85.0%～98.5%[17]。本研究对标本的采集、运输、检验工作展开严格质控，标本采集人员均通过严格培训，标本采集后及时送检，结果显示细菌培养法检出率仍偏低，仅为3.4%，而FQ-PCR法检出率高达10.7%，提示FQ-PCR法具有更高的灵敏度、特异度，这也是对筛查方法的基本要求。因此，FQPCR法有望成为今后妊娠晚期GBS的常规检测方法。

对GBS携带孕妇采取积极有效的预防和治疗措施，可治疗围生期孕妇感染，减少新生儿感染并降低新生儿死亡率[18]。CDC推荐对有高危因素或筛查阳性者产程中预防性使用抗生素(intrapartom antibiotic prophylaxis，IAP)，可有效降低围生期感染[19]。IAP首选药物为青霉素G，有青霉素过敏史但非速发型超敏反应者可选用头孢唑啉，对青霉素过敏且为速发型超敏反应者选择克林霉素，若克林霉素耐药，改用万古霉素[6]。随着IAP的实施，围生期GBS感染的发生率和危害大幅降低，但是抗生素的过度使用，带来了GBS的耐药问题。近年Lu等[20]对北京地区孕妇定植GBS菌株的耐药情况展开研究，发现克林霉素耐药率高达55.7%，国内其他地区文献报道GBS对克林霉素的耐药率范围为26.7%～83.7%[21-23]。我国GBS克林霉素耐药现象严峻，其作为青霉素过敏孕妇的IAP替代方案值得商榷。本研究33例细菌培养阳性的GBS药敏结果显示，13种抗菌药物耐药率为0.0%～63.7%，其中四环素的耐药率最高，为63.7%，克林霉素的耐药率为24.3%，低于Lu等[20]的报道，这可能与本研究样本量小，细菌培养阳性率低，或地域差异有关。近年来多项研究证明GBS对青霉素仍保持高度敏感，Wang等[24]研究中GBS菌株对青霉素全部敏感。本研究发现GBS对青霉素G的敏感性为100.0%，与国内相关研究一致，提示青霉素仍可作为GBS感染IAP的首选药物。

综上所述，妊娠晚期GBS感染可造成多重不良妊娠结局，目前已引起围生医学界的高度重视。应用FQPCR法能够提高GBS的阳性检出率，具有速度快、灵敏度高的特点，显著优于传统的细菌培养法，值得临床推广应用。对GBS感染者实行IAP，有助于改善妊娠结局及新生儿预后，然而GBS的耐药问题日益严峻，寻找GBS感染的危险因素和有效预防方法是今后重要的研究方向，有利于规范我国妊娠期GBS感染的筛查和防治策略。

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