牛膝多糖对硝普钠诱导的兔关节软骨细胞凋亡的影响及机制研究

周叶 高越 王晓楠 朱立 厉蓓

骨关节炎是年龄相关性疾病，目前认为该病的病理核心是关节软骨退变。笔者前一阶段的临床实验已经证实，取自《千金方》中的独活寄生汤和《医林改错》中的身痛逐瘀汤中的诸药加以化裁而成的“骨痹活血汤”能明显改善膝骨关节炎患者的临床症状，并且对其体内炎症因子NF-κB、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）等均具有明显下调作用[1]。川牛膝是该方剂中的主要药材，牛膝多糖（ABPS）则是中药牛膝的有效成分，它是一种免疫调节剂。现代药理学研究证实ABPS具有抗肿瘤、抗衰老、细胞毒和多种免疫调节作用。但在之前的临床实验中ABPS的治疗作用是否是通过调控软骨细胞凋亡信号传导通路，从而延缓关节软骨的退变，维持关节软骨正常的生物力学功能，尚未进一步研究。本实验通过建立体外培养的兔软骨细胞体系，利用ABPS对软骨细胞的凋亡以及凋亡信号传导途径进行研究，以期为其临床应用提供更多的理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂 6周龄新西兰大白兔1只，体重0.6kg，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。DMEM完全培养基、FBS（美国GibcoBRL公司），甲苯胺蓝、ABPS、白芦藜醇、尼克酰胺、硝普钠、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（美国Sigma公司），实时荧光定量PCR试剂、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TAKARA公司），细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2X）（立陶宛 MBI Fermentas公司），Trizol抽提试剂盒（美国Invitrogen公司）。RT-PCR引物均由金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 原代软骨细胞提取及培养 将新西兰白兔于耳缘静脉注射空气处死。无菌操作下沿膝关节内侧切开关节囊，暴露关节面，用手术刀片取关节表面软骨，用含青霉素钠/庆大霉素双抗液的PBS缓冲液冲洗数次后，移入超净台，将软骨组织剪碎至1mm3的大小。加入0.25%胰蛋白酶5ml，磁力棒摇荡消化30min，轻轻吹打弃去上清液，用PBS缓冲液清洗3次；再加入2g/L的Ⅱ型胶原酶5ml并移入消化瓶中，将消化瓶放置恒温摇箱中，消化3～4h。待大部分细胞游离时，经200目不锈钢筛网过滤，用15ml离心管收集细胞，低温离心1 000r/min，10min，弃上清液，加入含10%FBS的DMEM培养基，用吸管轻轻吹打，使细胞悬液均匀分布。

1.2.2 软骨细胞的观察与鉴定 取软骨细胞于倒置显微镜下观察生长情况及形态变化特点，并进行摄片记录。取对数生长期细胞进行爬片，PBS清洗后多聚甲醛固定10min，甲苯胺蓝染色30min，显微镜下观察软骨细胞。

1.2.3 软骨细胞培养 软骨细胞置于5%CO2混和气体环境中，37℃恒温箱内单层培养，隔3d首次换液，传代培养期间，每隔2～3d根据细胞生长情况更换1次完全培养基。待镜下观察细胞增殖汇集成片，并铺满培养瓶底。占底面积70%～80%可进行传代培养，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞后，按1∶3比例接种至75cm2培养瓶中，并标记为P1代细胞。按上述方法，培养至P3代软骨细胞。

1.2.4 分组 选取对数生长期的P3代软骨细胞，以3×105个/孔接种于6孔板中，培养24h细胞贴壁后加入不同浓度药物，分为：（1）无凋亡诱导组（10%FBS DMEM培养基培养）；（2）硝普钠组（1.0mmol/L硝普钠＋10%FBS DMEM 培养基培养）；（3）白芦藜醇组（1.0mmol/L硝普钠＋100μmol/L白芦藜醇＋10%FBS DMEM培养基培养）；（4）尼克酰胺组（1.0mmol/L硝普钠＋20mmol/L尼克酰胺＋10%FBS DMEM 培养基培养）；（5）ABPS 200μg/ml组（1.0mmol/L 硝普钠＋200μg/ml ABPS＋10%FBS DMEM培养基培养）；（6）ABPS 300μg/ml组（1.0mmol/L硝普钠＋300μg/ml ABPS＋10%FBS DMEM 培养基培养）；（7）ABPS 400μg/ml组（1.0mmol/L 硝普钠＋300μg/ml ABPS＋10%FBS DMEM培养基培养）。

1.2.5 软骨细胞凋亡率检测 根据1.2.4处理与分组细胞后，继续培养48h后用不含EDTA的胰酶消化、收集细胞。用预冷的PBS洗涤细胞2次，收集（1～5）×105细胞。加入100μl 1×Binding Buffer重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温反应 10min。加入 400μl 1×Binding Buffer，混匀，样品在1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 NAMPT、Sirt1、p53和 Bax mRNA 表达水平测定用Trizol法提取P3代软骨细胞RNA，行RT-PCR法获得cDNA，冰上混合脱氧核糖核酸嵌合荧光染料（DNA Master SYBR Green I Mix）10μl，上下游引物各 0.4μl、双蒸水5.2μl及cDNA 4μl，轻轻混匀，离心5s后进行RTPCR检测。反应条件为50°C预变性 2min，95°C变性10min，95°C 退火 30s，60°C 延伸 30s，40 个循环。反应完毕后分析产物溶解曲线判断反应的特异性并通过2-ΔΔCt得到目的基因的相对表达量。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism 6.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 软骨细胞镜下观察 制备的兔原代软骨细胞体外培养状态下大多呈透亮椭圆形、短梭形、多角形，72h基本全部贴壁生长，见图1。

2.2 ABPS对硝普钠诱导的软骨细胞凋亡的影响 与无凋亡诱导组比较，硝普钠组软骨细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）。与硝普钠组比较，白芦藜醇组、ABPS各组软骨细胞凋亡率均明显下降（均P＜0.05），而尼克酰胺组软骨细胞凋亡率明显上升（P＞0.05）。与ABPS 200μg/ml组比较，ABPS 300μg/ml组及 ABPS 400μg/ml组软骨细胞凋亡率明显下降（均P＜0.05），见图2-3。

图1 兔膝关节软骨细胞镜下观察（×200）

图2 细胞凋亡流式分析图

2.3 各组软骨细胞NAMPT、Sirt1、p53和Bax mRNA表达水平比较 与无凋亡诱导组比较，硝普钠组凋亡相关基因p53和Bax mRNA的表达明显上调，抗凋亡基因NAMPT和Sirt1 mRNA的表达明显下调，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与硝普钠组比较，白芦藜醇组NAMPT和Sirt1 mRNA的表达上调，p53和Bax mRNA的表达明显下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；尼克酰胺组NAMPT和Sirt1 mRNA的表达下调，BAX mRNA的表达上调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。不同浓度ABPS组中，ABPS 300μg/ml组效果最明显，NAMPT和Sirt1 mRNA的表达明显上调，p53和Bax mRNA的表达明显下调，与硝普钠组比较差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表 2。

3 讨论

骨关节炎是一种常见的慢性关节疾病,其主要病变是骨关节软骨的退行性病变和继发骨质增生，是多种生物因素与机械损伤因素相互作用而引起的生物力学紊乱所致的病理改变[2-3]。最容易累及负重和关节活动度大的膝关节，其次为髋关节、脊柱、手指关节等部位。它所带来的疼痛、关节功能障碍等症状严重影响了人们的生活质量。因此，如何有效地调控软骨细胞的功能，维持关节软骨正常生物学功能日益成为科研的重点。根据文献，P1代至P3代兔关节软骨细胞为研究退行性骨关节病最适宜的靶细胞[4]，因此，本实验采用P3代兔关节软骨细胞作为实验对象，建立凋亡模型。

在细胞的生命活动过程中，细胞凋亡与细胞增殖一样，都离不开信号的传导，即细胞增殖或死亡的刺激信号通过细胞外、细胞膜、细胞浆、细胞核，最后产生应答的途径传导。近年来的研究一致认为p38信号通路是关节软骨细胞凋亡的一条重要上游信号通路之一[5]。p38通过两条途径使p53蛋白表达增加而引起软骨细胞凋亡：一是磷酸化IKK（IκB的一个上游激酶），从而使NF-κB活化，进而增加p53的转录表达；二是直接磷酸化p53的丝氨酸15残基，稳定p53蛋白，使其含量增加。p53则通过诱导促凋亡因子Bax的表达而引起细胞凋亡[6]。与促凋亡因子相反的是抗凋亡因子。Sirt1是Sir2在哺乳动物的同源基因，是一种依赖NAD+的组蛋白去乙酰化，能与多种转录因子如p53、Ku70、PGC-1等相互作用，调节其转录活性，与细胞衰老、凋亡、代谢和增殖分化密切相关。Takayama等[7]研究证实Sirt1与人体软骨细胞凋亡相关。Liu等[8]发现SRT1720能够激活Sirt1，抑制软骨细胞凋亡。NAMPT广泛表达于人体内脏脂肪组织、肌肉、骨骼、肝脏等器官和组织，并表达于神经细胞、成纤维细胞、心肌细胞、免疫细胞等多种细胞，可见该蛋白在生理及病理状态下均有重要作用[9]。研究发现，NAMPT通过调节Sirt1活性控制相应基因转录和众多代谢过程，具有抗凋亡作用[10]。硝普钠可以诱导软骨细胞凋亡[11]，本实验中硝普钠凋亡诱导组的p53、Bax基因的表达明显高于其他组，说明在凋亡过程中存在p53-Bax信号传导通路的异常激活。

图3 ABPS对硝普钠诱导的软骨细胞凋亡的影响（与无凋亡诱导组比较，*P＜0.05；与硝普钠组比较，△P＜0.05；与 ABPS 200μg/ml组比较，▲P＜0.05）

表2 各组软骨细胞NAMPT、Sirt1、p53和Bax mRNA表达水平比较（n＝6）

本实验利用了白芦藜醇和尼克酰胺2种试剂，白芦藜醇是Sirt1的激动剂[12]，尼克酰胺是Sirt1的抑制剂[13]。RT-PCR检测发现白芦藜醇能使NAMPT和Sirt1 mRNA表达上调，经p53-Bax途径抑制硝普钠诱导的关节软骨细胞凋亡；尼克酰胺则下调NAMPT和Sirt1 mRNA的表达，并经p53-Bax途径加强硝普钠诱导的关节软骨细胞凋亡。流式细胞仪对细胞凋亡率的检测亦发现，白芦藜醇组细胞凋亡率远远低于硝普钠组，尼克酰胺组则高于硝普钠凋亡诱导组，证明白芦藜醇通过对Sirt1的调控抑制软骨细胞的凋亡，而尼克酰胺能促使软骨细胞凋亡，这与文献报道也是一致的[14]。

本实验在体外用ABPS干预硝普钠诱导的软骨细胞凋亡，发现ABPS有类似于白芦藜醇的作用，能够上调抗凋亡基因NAMPT和Sirt1 mRNA的表达及下调凋亡基因p53和Bax mRNA的表达。流式细胞仪检测同样证实ABPS处理后，兔关节软骨细胞凋亡率均有所降低，且凋亡率随其浓度的增加而减小，表明ABPS对凋亡诱导条件下软骨细胞具有保护作用，且在浓度为300μg/ml时即可以出现明显效果。由此笔者得出初步结论，ABPS通过上调抗凋亡基因NAMPT和Sirt1 mR－NA的表达及下调凋亡基因p53和Bax mRNA的表达，经p53-Bax途径来抑制硝普钠诱导的关节软骨细胞凋亡。这是ABPS保护软骨细胞、预防骨关炎的机制之一，也为ABPS的临床应用提供实验依据。但是本研究也存在不足之处，例如ABPS具体通过影响哪种凋亡机制来保护软骨细胞，还通过哪些信号传导通路影响了凋亡机制等。钟甫华等[15]利用实验证实经前交叉韧带离断术4周制动饲养后，大白兔关节软骨出现了降解破坏的形态特征，利用这种方法亦可以验证ABPS是否在动物体内实验中具有意义。以上几个方面都将是后续研究重点关注的方向。

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