杭州市儿童猩红热病原学及其相关血链球菌毒力基因分析

黄银燕，温圆圆，刘 伟，程庆林，吴亦斐，贾庆军，谢 立

猩红热(Scarlet Fever)是由能产生红疹毒素的A群链球菌(Group A streptococcus isolates, GAS)即化脓链球菌(S.pyogenes)感染所引起的急性呼吸道传染病，3～15岁儿童多发，在托幼机构和中小学易引起聚集性发病，是我国法定的乙类传染病之一。我国猩红热每年都有流行，尤其在2011年中国大陆发生了全国性的猩红热暴发流行，杭州市同样受到波及，发病率呈现明显上升。为探究杭州市儿童猩红热的病原学特征及分子分型，从病原学角度了解杭州市儿童猩红热发病率上升的原因，我们在2016年4月至2018年6月期间采集杭州市儿童医院报告的儿童猩红热病例及幼儿园健康幼儿的咽拭子标本进行病原学检测。

1 材料与方法

1.1实验菌株 实验菌株分离于杭州市儿童医院采集的32例猩红热患者咽拭子以及杭州市某幼儿园健康儿童咽拭子标本215份。

1.2实验材料 哥伦比亚血平板；5%牛血清的脑心浸液；A群链球菌抗原检测试剂盒(胶体金法)[美艾利尔(上海)医疗器械销售有限公司]； DNA裂解液； 苯酚氯仿抽提液；TaKaRa Ex Taq。

1.3链球菌的分离鉴定 化脓链球菌的分离培养依据WS 282-2008 《猩红热诊断标准》进行，挑取具有β溶血的可疑菌，分离后进行革兰氏染色，并使用A群链球菌抗原检测试剂盒和16S rRNA基因测序进行鉴定。分离培养得到的α溶血菌株采用16S rRNA基因测序进行鉴定。细菌基因组DNA抽提采用苯酚氯仿法，并以细菌基因DNA为模版PCR扩增16S rRNA基因，产物送上海生工生物有限公司进行测序。

1.4化脓链球菌的emm基因分型 以细菌基因组DNA为模版进行PCR扩增emm基因。引物参考美国CDC网站(http://www.cdc.gov/streplab/protocol-emm-type.html)。扩增产物送上海生工生物有限公司进行测序，测序结果分别在NCBI和CDC Home中与已知的emm序列进行同源性比对，确定各菌株的emm型别。

1.5血链球菌S28毒力基因扩增 参考病原菌毒力基因数据库(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)，选取化脓链球菌常见毒力基因emm、speB、smeZ、speC、speG、speK、ssa、mf/spd、mf2、mf3、mf4，每一个毒力基因取病原菌毒力基因数据库中5株不同化脓链球菌的相应序列(菌株亲缘关系尽可能远，毒力基因对应的链球菌少于5株的，取全部菌株)，设计简并引物进行扩增，简并引物设计采用Primer5。

参考病原菌毒力基因数据库中与S28同种的S.sanguinisSK36的毒力基因，选取化脓链球菌和血链球菌 SK36共有的毒力基因lmb、tig、plr/gapA、psaA、fbp54，使用血链球菌 SK36的基因序列，设计引物进行扩增，引物设计采用Primer5。

2 结 果

2.1链球菌的分离鉴定 从32例临床诊断的猩红热患者咽拭子分离链球菌22株，其中化脓链球菌占31.82%(7/22)，其余菌均属于缓症链球菌群(Mitis group)[1]，在血平板上呈现α溶血，包括口腔链球菌(S.oralis)占27.27%(6/22)，唾液链球菌(S.salivarius)占22.73%(5/22)，血链球菌(S.sanguinis)占13.64%(3/22)，嵴链球菌(S.cristatus)占4.54%(1/22)。从杭州某幼儿园健康儿童215份咽拭子中共分离出可培养的链球菌36株，分属9种不同的链球菌种类。其中化脓链球菌占11.11%(4/36)，其余菌都属于缓症链球菌群，包括唾液链球菌19.44%(7/36)占比最高，其次是婴儿链球菌(S.infantis)与嵴链球菌各占13.89%(5/36)，缓症链球菌(S.mitis)和口腔链球菌各占11.11%(4/36)，星座链球菌(S.constellatus)、血链球菌均占8.33%(3/36)以及1株(2.78%，1/36)假肺炎链球菌(S.pseudopneumoniae)，见图1。

2.2化脓链球菌emm基因分析 从临床猩红热患者分离的7株化脓链球菌中，共鉴定出3种emm基因型，其中emm1型4株，emm12型2株，另1株为emm22型。

2.3血链球菌S28毒力基因扩增与分析 S28分离于临床诊断的猩红热患者咽拭子，16S rRNA基因与血链球菌NCTC7863，血链球菌 NCTC11086、血链球菌 NCTC11085和血链球菌 SK36同源性均为99%。SK36是病原菌毒力基因数据库(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)中唯一有毒力基因数据信息的缓症链球菌群，并且已全基因组测序，因此选用S28研究毒力基因。

从S28中，扩增得到基因lmb(309aa)的氨基酸序列与血链球菌 SK353的黏附蛋白(WP_002897412.1)有97%的同源性，该蛋白为类TroA 超家族中的ABC转运以及底物结合蛋白。扩增得到基因tig(427aa)的氨基酸序列与血链球菌 SK1087的触发因子(Trigger factor) (WP_002920187.1)有99%同源性，该蛋白为Trigger_N超家族蛋白。扩增得到基因gapA(335aa)的氨基酸序列与血链球菌 SK36的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(WP_002899102.1 )有100%的同源性。扩增得到基因psaA(309aa)的氨基酸序列与血链球菌SK150的黏附素SsaB (Adhesin SsaB)有99%的同源性，该蛋白属于ZnuA超家族蛋白。扩增得到基因fbp54(549aa)的氨基酸序列与链球菌 CCH8-C6的纤连蛋白Fibronectin(WP_060976766.1)有99%的同源性，属于FbpA超家族蛋白。

图1 从猩红热病例分离的链球菌分布(左)，从健康儿童分离的链球菌分布(右)Fig.1 Distribution of Streptococcus species from scarlet fever (left), distribution of Streptococcus species from healthy children (right)

根据毒力基因emm、speB、smeZ、speC、speG、speK、ssa、mf/spd、mf3、mf4设计简并引物均未扩增到片段。根据毒力基因mf2设计的简并引物扩增到一条300 bp左右的片段，与 SK36全基因组992975 到 993308区域同源性高达98%，用 SK36基因组36992975-993308两端序列设计引物，PCR扩增得到完整的基因片段mf2(253aa)的氨基酸序列与血链球菌 SK340的链道酶(Streptodornase)同源性高达100%。

表1 S28中的毒力基因
Tab.1 Virulence genes in S28

基因氨基酸aa参考菌株氨基酸同源性/%潜在功能lmb309aa SK35397黏附蛋白tig427aa SK108799半胱氨酸蛋白酶的分泌和成熟中的必须蛋白gapA335aaSK36100黏附蛋白psaA309aa SK15099黏附蛋白fbp54549aa CCH8-C699纤连蛋白(黏附)mf2253aaSK340100链道酶(DNA酶)

3 讨 论

本研究中，从猩红热患者咽拭子分离的化脓链球菌共7株，携带率为21.88%(7/32)，缓症链球菌群携带率46.88%(15/32)。从健康幼儿咽拭子分离出化脓链球菌共4株，携带率为1.86%(4/215)，而缓症链球菌群的携带率为14.88%(32/215)。有研究表明健康儿童的化脓链球菌携带率为3%～26%，平均携带率为12%，年龄越低，检出率越低，其中5岁以下幼儿化脓链球菌平均携带率为3%～17%[2-3]。本研究中健康儿童化脓链球菌携带率略低，可能与携带缓症链球菌群有关。

emm基因型主要是emm1型和emm12型，各占57.1%和28.6%。全世界主要的emm型别是emm1和emm12[4]，国内北京、山东和上海的主要流行株也是emm12和emm1[5]。另一项针对国内8个省市2009年至2016年分离的140株化脓链球菌的研究表明emm12占42.9%，emm1占30.7%[6]。虽然本研究样本量不大，但研究结果符合我国由化脓链球菌引起的猩红热的分子流行特征。

由图1可知从猩红热病例咽拭子分离到的链球菌68.18%(15/22)为缓症链球菌群。近年来流行病学研究显示越来越多的非A群溶血性链球菌在喉咽部发现[7]。口腔缓症链球菌位置转移后可致病[8]。缓症链球菌群可以引起猩红热样皮疹、心内膜炎、新生儿脑膜炎、菌血症[9]。从1990年冬至1998年春，江苏省海安县等地发生了178起由缓症链球菌群所致的猩红热样疾病流行，重症者表现为中毒性休克综合征(TSS)[10-11]，研究者还从其中一株缓症链球菌(S.mitis)中分离到了34-kDa的新型致热外毒素[11]。海安县同时也发现了多例由血链球菌引起的中毒性休克综合征(TSS)，并且在病人血液中分离到了血链球菌[12-13]。在英国和泰国都曾报道由缓症链球菌引起的猩红热样毒素综合症[14-15]，在日本也曾报道由猪链球菌引起养猪农民患猩红热样毒素综合征[16]。因此本研究中，15例分离到缓症链球菌群的儿童猩红热病例，虽然在临床上被诊断为猩红热，但与前面江苏报道的病例一样，是由缓症链球菌群引起的猩红热样疾病。除了江苏海安对缓症链球菌的研究以外，目前国际上对于缓症链球菌群引起猩红热样疾病分子机理的研究尚未报道。猩红热患者缓症链球菌群携带率46.9%(15/32)，大于化脓链球菌的携带率21.8%(7/32)。因此，杭州市儿童猩红热发病率上升的原因是部分被诊断为猩红热的病例实际上是由缓症链球菌群引起的猩红热样病例，而非化脓链球菌引起的猩红热。

本研究从血链球菌S28中分离鉴定到了6个链球菌毒力基因。基因fbpA编码纤连蛋白结合蛋白FbpA，起到黏附、转移和分化的作用[17]，促进化脓链球菌在宿主内的传播[18]。基因gapA编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH，可以锚定在咽部细胞表面，破坏宿主组织细胞，还可通过抑制吞噬作用，帮助化脓链球菌逃逸免疫监视[19]。基因lmb编码ABC转运蛋白中的金属结合脂蛋白AdcAII，是一种黏附蛋白[20]，并与Zn(II)、Fe(III) 和Cu(II)的转运有关[21]。基因PsaA编码金属结合蛋白SsaB(saliva-binding protein)，是宿主表面黏附蛋白[22]。在肺炎链球菌中，蛋白PsaA不仅有助于肺炎链球菌在鼻咽部的定植，并具有免疫原性[23]。基因tig编码Trigger factor(TF)，是核糖体结合分子伴侣和肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶(PPIase)，在化脓链球菌的半胱氨酸蛋白酶的分泌和成熟过程中是必须的,半胱氨酸蛋白酶可增加细菌的侵袭性[24]。基因mf2编码有丝分裂因子(Mitogenic factor)，是化脓链球菌的DNA酶[25]，即链道酶，能降解脓液中具有高度粘稠性的DNA，使脓液稀薄，促进病菌扩散，并且能致敏T细胞[26]。

国际上报道的血链球菌主要分离于健康人的口腔[27]和心内膜炎患者[28]，除了国内江苏海安的报道，目前国际上尚无从猩红热病人咽拭子分离血链球菌的研究。本研究首次在分离于猩红热样病人咽拭子的血链球菌S28中发现6个毒力基因，其中fbpA、gapA、lmb、psaA都是表达黏附因子的基因，有助于S28在咽部定植。基因mf2是化脓链球菌致病的关键基因，在全基因组测序的血链球菌 SK36中并没有发现这个基因，本研究是第一次在分离于猩红热样病人咽拭子的血链球菌中克隆到链道酶基因。血链球菌 SK36是牙齿表面的定植菌[29]，不引起化 脓，并不需要链道酶发挥作用。而S28在咽部定植并会引起化脓感染，链道酶可以促进S28在脓液中扩散或者致敏T细胞，因此，基因mf2可能在S28引起猩红热样疾病中很关键。

利益冲突：无