子宫平滑肌前列腺素E2受体分布与复发性自然流产发病机制的相关性研究

李旭升 洪丽霞 金庆跃

复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指妊娠28周以内2次以上连续发生的自然流产[1]，是妊娠期妇女的常见并发症之一[2]，发病率约占育龄夫妇的5%[3]。引起RSA的因素复杂多样，约50%的RSA的发病机制尚不明确[4]。有许多未知的体内外刺激能够引起子宫平滑肌细胞异常收缩，从而造成流产[5]。前列腺素（prostaglandin，PG）是一类普遍存在于人和动物体内的具有多种生理作用的活性脂质[6]，它通过环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和不同的膜相关前列腺素E合成酶（membrane-associated prostaglandin E synthase，mPGES）催化产生[7]。子宫的PG主要来源于子宫内膜，前列腺素E受体（EP）主要在肌细胞膜上表达[8]。PG能引起子宫强烈的收缩，非妊娠子宫的EP含量高于妊娠子宫[9]。笔者推测前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及其受体EP表达水平的异常可能与RSA有关。然而RSA患者的PGE2的合成水平和子宫平滑肌细胞EP受体的分布情况鲜有报道，其机制尚有待于进一步研究。本研究测定了RSA患者子宫蜕膜组织中COX-2、mPGES和PGE2的表达和子宫平滑肌细胞中EP受体的分布及其下游的信号分子钙离子和环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的水平，以探讨 PGE2/EP系统在RSA中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2015年6月至2016年10月金华市人民医院妇产科门诊收治的37例RSA患者作为RSA组。RSA患者入组标准：（1）B超提示胚胎已死亡，自然流产次数＞2 次；（2）孕 12周以内；（3）染色体核型、妇科检查、抗人球蛋白实验（Coombs试验）、优生4项（TORCH检测）、抗心磷脂抗体检测等均无异常；（4）无其他急慢性疾病；（5）丈夫精液检查正常。选择同期正常早期妊娠的采用吸宫术人工流产的48例孕妇作为对照组。RSA 组年龄 22～30（26.8±3.1）岁，孕周 8～13（8.9±2.2）周，未接受任何药物保胎治疗；对照组年龄21～30（25.9±2.7）岁，孕周 8～11（9.2±1.9）周；两组对象年龄和孕周比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

1.2 实验材料与仪器 PGE2ELISA试剂盒、cAMP ELISA试剂盒购自美国Abcam公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒和SYBY Green Mix购自北京全式金生物技术公司；荧光定量PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司；钙离子检测染料Fluo-3 AM购自日本东仁化学公司；PCR引物由上海博尚生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1 子宫平滑肌细胞分离与鉴定 子宫肌膜组织通过宫腔镜活检获得，并立即进行后续子宫平滑肌细胞分离。取子宫肌膜组织约0.5g，置于冰冷的Hank′s平衡缓冲液（HBSS）中，洗净组织表面血污。于10ml培养皿内，用眼科剪将组织剪碎成浆样，加入HBSS缓冲液5ml，吹打制成组织悬液，8 000r/min离心2min，弃上清液。留下的组织内加入20%FBS 2ml，吹打，再次离心夹取组织块，点种于6孔板或12孔板，向培养孔内缓慢加入20%FBS约2ml，使液面刚好没过组织块。将培养板转入孵箱。前4d可不必观察。每4～6d换液1次，若有组织块漂起，可吸除。观察至组织块之间的细胞互相融合，即可直接用于实验处理，或传代后继续培养。利用α-actin荧光抗体进行免疫荧光染色，在激光共聚焦显微镜下可看到细胞被染成绿色荧光。

1.3.2 蜕膜组织中COX-2、mPGES和子宫平滑肌细胞中EP受体表达水平检测 采用RT-PCR。蜕膜组织通过负压吸引术获得，于液氮中保存使用。将蜕膜组织从液氮中取出，置于1ml Trizol试剂中。对于分离的培养于细胞培养板的子宫平滑肌细胞，每孔中加入Trizol试剂中，刮下细胞转移至离心管中。振荡混匀后冰上放置5min，12 000g离心15min，吸取澄清部分加入等体积异丙醇中，混匀后冰上静置10min，12 000g离心15min，弃上清液，向离心管中加入1ml预冷的75%乙醇溶液，轻轻振荡后7 500g离心5min，弃上清液，沉淀用无RNA酶的双蒸水溶解。按说明书所述方法提取mRNA。采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，作为RTPCR的模板。各目标分子的引物序列见表1。引物合成后稀释为2μM。反应体系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 5μl，上游引物和下游引物各 1μl，cDNA 模板 1∶10 稀释后取1μl，剩余用不含RNA酶的水补足，总体积10μl。PCR反应条件如下：预变性95℃ 30s；变性95℃ 3s；退火延伸60℃30 s；构建溶解曲线。表达量的计算采用2-ΔΔCt。

1.3.3 蜕膜组织中PGE2表达水平检测 向解冻的蜕膜组织加入蛋白酶抑制剂后，超声破碎，23 000g离心15min，取上清液。根据ELISA检测试剂盒的说明书按照不同的稀释倍数制备标准品，并将样本按1∶10稀释到ED1样品缓冲液内。按照说明书操作步骤在酶标仪上测量450nm处的光密度（OD）值，根据标准曲线计算出实际的PGE2的含量。

表1 PCR引物序列

1.3.4 子宫平滑肌细胞中cAMP表达水平检测 子宫平滑肌细胞中cAMP表达水平按照ELISA试剂盒要求处理细胞并进行测定。

1.3.5 胞内钙离子信号检测 将1～5mM的钙离子荧光探针Fluo-3 AM母液用HBSS缓冲液配制成1～5μM的工作液，取出分离的子宫平滑肌细胞，除去培养基，用HBSS缓冲液洗涤细胞3次；加入Fluo-3 AM工作液，溶液量以覆盖细胞为准，37℃细胞培养箱孵育10～60min；去除残留的Fluo-3 AM工作液，然后加入HBSS缓冲液覆盖细胞，37℃培养箱孵育约20～30min，以确保钙离子荧光探针Fluo-3 AM在细胞内被酯酶剪切从而与钙离子结合。采用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞，激发波长480～500nm，发射波长525～530nm。利用IPWIN32软件分析两组数据荧光强度差异。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组蜕膜组织中COX-2、mPGES和PGE2表达水平比较 RSA组蜕膜组织中COX-2和mPGES表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1。RSA组蜕膜组织中PGE2表达水平为（72.26±27.42）pg/ml，显著高于对照组的（61.61±18.2）pg/ml，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图1 两组蜕膜组织中COX-2和mPGES表达水平比较（与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 两组子宫平滑肌细胞中EP受体表达水平比较RSA组子宫平滑肌细胞中EP1和EP3表达水平均高于对照组（均P＜0.01），而EP2表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；而两组子宫平滑肌细胞中EP4表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

2.3 两组子宫平滑肌细胞中钙离子浓度和cAMP表达水平比较 RSA组子宫平滑肌细胞胞内钙离子浓度显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3（插页）。RSA组子宫平滑肌细胞中cAMP表达水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见图4。

图2 两组子宫平滑细胞中EP受体表达水平比较（与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

图4 两组子宫平滑肌细胞中cAMP表达水平比较（与对照组比较，*P＜0.01）

3 讨论

RSA是困扰育龄妇女的顽疾之一，近年随着环境变化等因素的影响RSA发病率有明显上升的趋势，且RSA复发的风险随着自然流产次数的增加而增加，有3次流产经历的RSA患者如果得不到及时有效的治疗，多数将再次自然流产，给孕妇心理和身体造成了极大的损伤[10]，目前已经成为临床研究的焦点。染色体异常是公认的最常见因素[11]；其次还有解剖因素，包括子宫畸形、宫颈功能不全等；另外，内分泌因素、环境因素等也是RSA的常见因素之一；除此之外，子宫平滑肌的不正常收缩也可能与RSA的发生有关[12]。在妊娠的早期阶段，适当的子宫平滑肌收缩有利于受精和着床。着床后至分娩前，子宫处于不规则、无痛性、稀发和不对称收缩的相对静止状态。然而，如果受到体内外不确定因素的影响，子宫收缩的稳态被打破，就有可能导致流产的发生。

王育等[13]研究发现绒毛组织中COX-2及其催化的PG通过影响胚胎的着床，从而参与RSA的发病机制。Popovic等[14]报道PGE2在RSA患者的蜕膜组织中的含量高于手术流产组，而在硫前列酮诱导的药物流产人群中，其蜕膜组织中PGE2水平和RSA患者相当。这提示PGE2急剧上升造成子宫收缩，进一步导致了流产的发生。本研究也得到了与类似结果，RSA组蜕膜组织中PGE2表达水平显著高于对照组。同时，负责合成PGE2的mPGES表达水平也高于对照组。RSA患者蜕膜组织中mPGES水平上调，导致PGE2的合成水平增加，这揭示了PGE2的上调参与了RSA的疾病进程。

PG主要通过和其位于细胞膜上的受体结合来发挥其生理作用。PGE2至少能够和4个亚型的EP受体结合，这些EP亚型受体均是G蛋白偶联受体，每一种受体会介导不同的信号通路[15]。第二信使钙离子、三磷酸肌醇（IP3）和cAMP在子宫收缩中起着关键性的作用。Slater等[16]报道维持妊娠期间蜕膜的正常功能，需要较低的PG水平和较高的cAMP水平，流产的发生往往是出现了是较高的PG水平和较低的cAMP水平。钙离子能够促进平滑肌细胞的收缩，而cAMP则能够促进子宫的静止。为了解在RSA中哪些EP受体及其偶联的G蛋白以及第二信使在发病过程中起到了重要的作用，笔者利用RT-PCR分析了子宫平滑肌细胞中EP的分布情况，发现EP1和EP3表达上调，而EP2表达下调。EP2和EP4通过异三聚体的G蛋白Gαs刺激腺苷酸环化酶的活性，促进cAMP的合成；而EP3则通过Gαi抑制腺苷酸环化酶的活性，降低cAMP的合成；EP1通过Gq蛋白促进磷脂酶C（PLC）的活性，使胞内钙离子水平升高。综合上述结果发现，EP1的上调促进了胞内钙离子的升高，而EP3上调和EP2下调则造成了cAMP水平的下降，其产生的共同结果就是子宫平滑肌细胞异常活跃的收缩。

综上所述，RSA患者子宫蜕膜组织的COX-2和mPGES表达上升，增加了子宫蜕膜PGE2的合成。PGE2作用于子宫肌层的EP受体，激活了下游信号通路，而子宫平滑肌细胞的EP1和EP3上调进一步促进胞内钙离子浓度和cAMP水平的变化，从而造成了子宫异常的收缩，可见PGE2/EP系统异常可能参与了RSA的发病。本研究为抗RSA药物的开发提供了新的思路。

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